聯(lián)合檢測(cè)血清miR-125b和AFP對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值*

左 鐸 羅 藝 郭 華 張 寧

聯(lián)合檢測(cè)血清miR-125b和AFP對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值*

左 鐸①羅 藝②郭 華②張 寧②

目的：探討血清中miR-125b作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的血清標(biāo)志物的可能性和聯(lián)合檢測(cè)miR-125b和AFP對(duì)HCC的診斷價(jià)值。方法：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)65例HCC患者和30例健康對(duì)照組的血清miR-125b表達(dá)量，分析其對(duì)HCC的診斷價(jià)值，以及與HCC臨床病理資料參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果：HCC患者組血清miR-125b表達(dá)與對(duì)照組相比較低，且兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-125b的表達(dá)與患者性別、年齡、乙肝表面抗原陽性、AFP、ALT和α-GGT的表達(dá)水平無關(guān)（P＞0.05）。miR-125b的表達(dá)與患者肝硬化、腫瘤大小和TNM分期有關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單獨(dú)檢測(cè)miR-125b的ROC曲線下的AUC為0.917（95%CI：0.851～0.960，P＜0.001），靈敏性為85.9%，特異性為93.5%，聯(lián)合miR-125b和AFP檢測(cè)的ROC曲線下的AUC為0.951（95%CI：0.894～0.982，P＜0.001），靈敏性為92.9%，特異性為93.5%，檢測(cè)AFP＜20 μg/L的HCC患者血清miR-125b的ROC曲線下的AUC為0.889（95%CI：0.776～0.957，P＜0.001），靈敏性為84.0%，特異性為87.1%。結(jié)論：聯(lián)合檢測(cè)血清miR-125b和AFP對(duì)早期診斷原發(fā)性HCC具有重要的臨床價(jià)值。

原發(fā)性 肝細(xì)胞癌 微小RNA 甲胎蛋白 診斷 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在世界惡性腫瘤中排名第6名［1］。亞洲和非洲地區(qū)是HCC患者的高發(fā)區(qū)［2］。由于早期確診率不高，大多HCC患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已經(jīng)處于肝癌晚期，伴隨高死亡率，自臨床診斷開始5年總生存率僅有5%～9%，錯(cuò)過了實(shí)施肝切除術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，且預(yù)后較差，具有高復(fù)發(fā)率，和抗化療等特點(diǎn)［1-3］。目前主要篩查HCC的檢測(cè)手段為影像學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。由于缺乏有效的預(yù)測(cè)和診斷的檢測(cè)手段，患者往往是通過活檢及手術(shù)探查才得到確診。血清學(xué)診斷HCC以AFP檢測(cè)為主，其最大問題就是靈敏性和特異性較低，分別只有39%～65%和76%～94%［4］。有研究者預(yù)測(cè)微小RNA（microRNA，miRNA）可以作為一種腫瘤標(biāo)志物來對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后進(jìn)行估計(jì)［5］。本研究聯(lián)合檢測(cè)HCC患者血清AFP和miR-125b可能有效地達(dá)到早期診斷HCC高靈敏性和高特異性的目的。Liang等［6］發(fā)現(xiàn)miR-125b在原發(fā)性HCC組織表達(dá)下調(diào)，并確定癌基因LIN28B是miR-125b的直接下游靶基因，miR-125b參與調(diào)控LIN28B和下游分子p21Cip1/ Waf1、c-myc和E-cadherin來抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Au等［7］發(fā)現(xiàn)HCC組織中的EZH2基因表達(dá)上調(diào)與miR-125b表達(dá)下調(diào)顯著相關(guān)，并通過一系列的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EZH2通過Wnt信號(hào)通路和MAPK/ ERK信號(hào)通路抑制miR-125b抗HCC轉(zhuǎn)移功能，這兩個(gè)通路與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些文獻(xiàn)報(bào)道均是在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平上研究HCC中的miR-125b，是否在循環(huán)血液中同樣也有類似的臨床價(jià)值，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)miR-125b在中國(guó)人群中原發(fā)性HCC患者與健康人的血清中的表達(dá)，分析比較之間的差異，并分析miR-125b與HCC臨床病理特征之間的相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)HCC患者血清miR-125b和AFP提高早期診斷原發(fā)性HCC的靈敏性和特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2011年5月至2012年12月期間本院肝膽外科經(jīng)病理確診為原發(fā)性HCC的患者血清標(biāo)本65例，患者男性48例，女性17例，年齡27～79歲，男性中位數(shù)年齡56歲，女性中位數(shù)年齡51歲；健康對(duì)照組男性17例，女性13例，年齡24～80歲，男性中位數(shù)年齡52歲，女性中位數(shù)年齡年齡49歲，兩組性別和年齡比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；颊呷朐呵熬催M(jìn)行手術(shù)或放化療治療。HCC患者病理資料完整，按照UICC（第7版）TNM標(biāo)準(zhǔn)對(duì)HCC進(jìn)行臨床病理分期（表1）?；颊吆徒】等司崭轨o脈抽血，用非抗凝劑的試管采集2～3 mL的血液標(biāo)本，分離血清。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 miR-125b主要試劑購(gòu)自美國(guó)ABI有限公司，分別為mirVanaTMPARISTM提取miRNA試劑盒，Taqman?miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taqman?miRNA qPCR試劑盒，TaqMan?Universal PCR混合試劑Ⅱ（不含UNG），TaqMan?small RNA引物（5×），Taq-Man?small RNA引物（20×）。采用的儀器分別為美國(guó)Beckman Coulter公司Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BIO-RAD公司S1000 Thermal Cycler普通PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。AFP試劑購(gòu)自Roche診斷產(chǎn)品（上海有限公司），采用Roche E170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。ALT、α-GGT試劑購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter有限公司，采用Beckman Coulter AU5821全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 用非抗凝劑的試管采集血液標(biāo)本后，3 000 r/min離心5 min，分離出血清。-80℃保存血清標(biāo)本。取200 μL血清，按照mirVana?PARIS?提取miRNA試劑說明書進(jìn)行提取miRNA。按照Taq-Man?miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按比例配制RT混合液，分別加入Taq-Man?hsa-miR-125b引物（5×）或內(nèi)參TaqMan?U6 sn-RNA引物（5×），使用RT-PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成cDNA后，按照TaqMan?miRNA qPCR試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，混合加入TaqMan?Universal PCR混合試劑Ⅱ（不含UNG），分別加入Taq-Man?hsa-miR-125b引物（20×）或內(nèi)參TaqMan?U6 snRNA引物（20×），miR-125b和內(nèi)參U6的特異引物序列見表2。根據(jù)miRNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 血清中miRNA的相對(duì)表達(dá)水平［8］：公式=2-△△Ct，△Ct=目標(biāo)基因Ct-內(nèi)參基因Ct，目標(biāo)基因Ct和內(nèi)參基因Ct來自同一標(biāo)本中的目標(biāo)基因Ct值和內(nèi)參基因Ct值?！鳌鰿t=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算均使用SPSS 19.0軟件完成。miR-125b相對(duì)表達(dá)水平采用中位數(shù)和四分位間距表示，Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析血清miR-125b水平的臨床意義。MedCalc 11.4軟件構(gòu)建ROC（receiver operating characteristic）曲線，確定血清miR-125b診斷HCC的臨界值（cutoff value）并計(jì)算AUC（area under the ROC curve）。采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)（兩組間比較）和KrusKal-Wallis H檢驗(yàn)（多組間比較）分析血清miR-125b與HCC臨床病理特征各參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 65例HCC患者miR-125b表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性 %Table 1 miR-125b expression in 65 HCC patients and its correlation with clinical pathologic data %

表2 miR-125b與內(nèi)參基因U6特異引物序列Table 2 Specific primer sequences of target miR-125b and reference gene U6

2 結(jié)果

2.1 HCC患者血清miR-125b表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系

HCC組血清miR-125b相對(duì)表達(dá)水平0.494（0.276～0.591），對(duì)照組血清miR-125b相對(duì)表達(dá)水平為1.446（1.085～1.701），HCC組血清miR-125b相對(duì)表達(dá)水平是健康對(duì)照組的0.342倍，HCC組中miR-125b表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.001）。將HCC組分為兩組，其中血清miR-125b相對(duì)表達(dá)水平＜0.494作為低表達(dá)組，血清miR-125b相對(duì)表達(dá)水平＞0.494作為高表達(dá)組。HCC患者56.9%（37/65）肝硬化，HCC患者47.7%（31/65）腫瘤＞5 cm，HCC患者TNM分期33.9%（22/65）Ⅰ期、41.5%（27/65）Ⅱ期、24.6%（16/65）Ⅲ～Ⅳ期。HCC患者血清miR-125b表達(dá)水平與肝硬化、腫瘤大小、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、HBsAg、AFP、ALT、α-GGT等均無關(guān)（P＞0.05）。

2.2 HCC患者血清miR-125b表達(dá)的靈敏性和特異性

單獨(dú)檢測(cè)HCC組和健康對(duì)照組的血清miR-125b和AFP，miR-125b靈敏性為85.9%，特異性為93.5%，AUC為0.917（95%CI：0.851～0.960，P＜0.001），其臨床診斷臨界值（cutoff value≤0.690），而AFP靈敏性僅為43.5%，特異性為93.3%，AUC為0.715（95%CI：0.623～0.795，P＜0.001）。聯(lián)合檢測(cè)HCC組和健康人對(duì)照組血清miR-125b和AFP，其靈敏性提高至92.9%，特異性為93.5%，AUC為0.951（95%CI：0.894～0.982，P＜0.001，圖1）。即使AFP＜20 μg/L的HCC患者也能通過檢測(cè)血清miR-125b診斷HCC，其靈敏性為84.0%，特異性為87.1%，AUC為0.889（95%CI：0.776～0.957，P＜0.001，圖2）。分別對(duì)AFP＜20 μg/L、AFP為20 μg/L～400 μg/L和AFP＞400 μg/L三組HCC患者血清miR-125b的靈敏性和特異性進(jìn)行分析（表3）。

圖1 血清miR-125b，AFP及聯(lián)合血清miR125b和AFP診斷HCC的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of serum miR-125b,AFP,and combination of serum miR-125b and AFP for the diagnosis of HCC

圖2 AFP＜20 μg/L的患者血清miR-125b診斷HCC的ROC曲線分析Figure 2 ROC curve analysis of serum miR-125b for the group（AFP＜20 μg/L）of HCC

表3 三組患者血清miR-125b作為診斷HCC的標(biāo)志物的性能預(yù)測(cè)Table 3 Predictive performance of serum miR-125b as biomarker for detection of HCC in three groups

3 討論

目前，診斷HCC的臨床手段還是影像技術(shù)（腹部超聲、MRI、加強(qiáng)CT），血清AFP檢測(cè)，以及創(chuàng)傷性較大的活檢病理學(xué)分期。血清AFP檢測(cè)可便捷應(yīng)用于HCC的初步診斷，歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（ESMO）指南建議AFP＞400 μg/L可以代替肝穿刺細(xì)胞學(xué)檢查［9］，但AFP升高也存在于良性肝臟疾病中。大約有1/3的小腫瘤（直徑＜3 cm）的HCC患者不能通過腹部超聲得到確診，特別是肥胖或有潛在肝硬化的患者可能會(huì)錯(cuò)過檢查出小病變的機(jī)會(huì)［4］。miRNA與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)特定堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA被降解或翻譯被抑制，從而對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用［10］。miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等過程，在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用［11］。近幾年文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)確定miR-125b作為抑癌基因在HCC組織中表達(dá)下調(diào)［6-7］。隨著研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中存在的miRNA穩(wěn)定性高，不易被RNA降解［12］。進(jìn)而有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b在非小細(xì)胞肺癌［13］和乳腺癌患者［14］血清中表達(dá)異常，但在中國(guó)人群中HCC患者血清miR-125b的臨床研究還少有人報(bào)道。本研究首次提出聯(lián)合血清miR-125b和AFP提高早期診斷原發(fā)性HCC的靈敏性和特異性。

本研究通過血清學(xué)檢測(cè)提示miR-125b是分泌型miRNA，不僅在HCC患者組織和HCC細(xì)胞株中存在［6-7］，在HCC患者血清中也同樣存在，且表達(dá)下調(diào)。本研究通過分析血清miR-125b與HCC臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清中的miR-125b的表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)（P=0.025）。通過miR-125b檢測(cè)有望預(yù)測(cè)TNM分期提示HCC患者區(qū)域淋巴結(jié)受累和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性。腫瘤直徑≥5 cm和腫瘤直徑＜5 cm分兩組分析發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑大小與血清miR-125b表達(dá)顯著相關(guān)（P=0.006），提示可有助于腹部超聲檢查腫瘤大小。有肝硬化和無肝硬化分兩組分析發(fā)現(xiàn)患者血清中的miR-125b的表達(dá)與肝硬化顯著相關(guān)（P=0.018）。在血清學(xué)診斷HCC方面，單獨(dú)檢測(cè)miR-125b靈敏性為85.9%，特異性為93.5%，AUC= 0.917（P＜0.001），通過ROC曲線確定血清miR-125b表達(dá)的臨床診斷臨界值（cutoff value≤0.690），即當(dāng)miR-125b相對(duì)表達(dá)水平2-ΔΔCt≤0.690可考慮患有HCC的可能。單獨(dú)檢測(cè)AFP靈敏性僅為43.5%，特異性為93.3%，AUC為0.715（P＜0.001），通過miR-125b與AFP聯(lián)合檢測(cè)，早期診斷HCC的靈敏性可提高至92.9%，與單獨(dú)檢測(cè)AFP特異性相比略有提高至93.5%，AUC為0.951（P＜0.001）。在AFP＜20 μg/L的HCC患者血清miR-125b診斷HCC的靈敏性為84.0%，特異性為87.1%，AUC為0.889（P＜0.001），提示通過對(duì)HCC患者血清中miR-125b的檢測(cè)有望可以降低血清AFP＜20 μg/L的HCC患者通過血清學(xué)篩查的漏檢率。

綜上所述，聯(lián)合血清miR-125b和AFP檢測(cè)可提高診斷原發(fā)性HCC的靈敏性和特異性，對(duì)早期診斷原發(fā)性HCC具有潛在的臨床價(jià)值。本研究將在接下來的工作中繼續(xù)增加標(biāo)本量進(jìn)一步驗(yàn)證本研究得出的結(jié)論，并通過觀察HCC患者治療前后血清中的miR-125b表達(dá)水平是否有差異，進(jìn)一步確定其是否可以作為治療患者的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。通過HCC患者預(yù)后情況來進(jìn)一步評(píng)估其是否為患者預(yù)后不良因素。miR-125b作為HCC的抑癌基因的機(jī)制較為復(fù)雜且不明確，也將進(jìn)一步探討miR-125b在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，希望miR-125b對(duì)HCC的診斷、監(jiān)測(cè)及治療方面發(fā)揮積極的作用。

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（2014-01-20收稿）

（2014-04-27修回）（本文編輯：周曉穎）

The diagnosis value of combined detection of serum mir-125b and alpha-fetoprotein for primary hepatocellular carcinoma

Duo ZUO1,Yi LUO2,Hua GUO2,Ning ZHANG2

Ning ZHANG;E-mail:nzhangchina@yahoo.com
1Department of Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,National"863"Plan Clinical Research Laboratory Tianjin 300060,China;2Laboratory of Cancer Cell Biology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Basic Research Program 973 of China(Grant No:2011CB933100),The National High Technology Research and Development Program 863 of China(Grant No:2011AA02A111),and Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital Level Program(Grant No:Y1302)

Objective:To investigate the possibility of miR-125b in serum as a novel tumor marker for primary hepatocellular carcinoma(HCC)and the diagnosis value of combined detection of miR-125b and alpha-fetoprotein(AFP)for HCC.Methods:We detected serum miR-125b expression of 65 cases of HCC patients and 30 cases of healthy controls by real-time quantitative PCR.Moreover,we analyzed the significance of miR-125b and explored the relationship between miR-125b and clinical pathological factors.Results:The level of miRNA-125b was down regulated in serum of HCC patients compared with healthy controls which showed significant differences(P< 0.05).Furthermore,the expression of miRNA-125b has no distinct correlation with sex,age,HbsAg,AFP,ALT and α-GGT,which had no significant differences(P>0.05).The expression level of miRNA-125b correlated the difference with liver Cirrhosis,tumor size and tumor node metastasis(TNM)stages,which were considered significant differences(P<0.05).The receiver operating characteristic(ROC)curve analysis of serum miR-125b for the diagnosis of HCC yielded AUC of 0.917(95%CI:0.851～0.960,P<0.001)with 85.9%sensitivity and 93.5%specificity.The ROC curve analysis of combined miR-125b andAFPfor HCC detection yieldedAUC of 0.951(95%CI:0.894～0.982, P<0.001)with 92.9%sensitivity and 93.5%specificity.The ROC curve analysis of serum miR-125b as biomarkers for the group(AFP<20 μg/L)of HCC yielded AUC of 0.889(95%CI:0.776～0.957,P<0.001)with 84.0%sensitivity and 87.1%specificity.Conclusion:Serum miRNA-125b combined withAFP has considerable clinical value for the early diagnosis of primary HCC

primary,hepatocellular carcinoma,micro-RNA,alpha-fetoprotein,diagnosis,quantitative real-time polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1000-8179.20140337

①天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家“863”計(jì)劃臨床研究實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）；②腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

*本文課題受國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃973項(xiàng)目（編號(hào)：2011CB933100）、國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃863項(xiàng)目（編號(hào)：2011AA02A111）和天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院院級(jí)課題（編號(hào)：Y1302）資助

張寧 nzhangchina@yahoo.com

左鐸 技師，碩士在讀研究生。研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

E-mail：13752126767@163.com