環(huán)磷酰胺聯(lián)合強(qiáng)的松建立人乳腺癌小鼠移植模型*

嵇 健 劉民鋒 楊翼鵬 郭昭澤 董建宇 葉長生

環(huán)磷酰胺聯(lián)合強(qiáng)的松建立人乳腺癌小鼠移植模型*

嵇 健 劉民鋒 楊翼鵬 郭昭澤 董建宇 葉長生

目的：將人乳腺癌細(xì)胞接種于具有正常免疫功能但受抑制狀態(tài)的小鼠，以期建立乳腺癌小鼠模型。方法：將40只雌性BALB/c隨機(jī)平均分成4組，按環(huán)磷酰胺和強(qiáng)的松用量多少分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。將人乳腺癌細(xì)胞接種于小鼠背部，觀察小鼠成瘤時間、成瘤率、腫瘤的影像、病理學(xué)表現(xiàn)及其重要內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移情況等。結(jié)果：高劑量組成瘤率高，成瘤時間早，且內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移多，小鼠死亡率高。中劑量組成瘤率較低，成瘤時間較晚，內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移少，小鼠死亡率低。對照組和低劑量組未見成瘤和小鼠死亡。結(jié)論：本實驗成功用環(huán)磷酰胺聯(lián)合強(qiáng)的松在免疫正常的小鼠中建立人乳腺癌小鼠移植瘤模型，較好的模仿乳腺癌在免疫正常的機(jī)體里的發(fā)生、發(fā)展過程。

環(huán)磷酰胺 強(qiáng)的松 免疫抑制 乳腺癌 小鼠 PET/CT

乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤之一，在美國，已成為女性癌癥的第二大死因［1］。我國乳腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，在大城市女性中居首位［2］。為了探索乳腺癌的生物學(xué)特點和新的治療方法，國內(nèi)外研究者借助乳腺癌動物模型，來對乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和治療展開研究。既往報道的人源性乳腺癌動物模型多采用裸鼠，但裸鼠費用高、生長環(huán)境要求高、壽命短。對于長期研究，裸鼠最大的缺點在于缺少對腫瘤的免疫反應(yīng)。本實驗則是將人乳腺癌細(xì)胞接種于具有免疫功能但受抑制狀態(tài)的小鼠體內(nèi)，以期建立具有正常免疫功能的乳腺癌動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 環(huán)磷酰胺（sigma）、甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉購自比利時法瑪西亞普強(qiáng)公司，青霉素鈉注射液購自北京悅康凱悅制藥有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶及PBS溶液均購自美國Gibco公司。

1.1.2 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自上海細(xì)胞生物研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基含10%胎牛血清和100 U/mL的青鏈霉素，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)基，采用胰蛋白酶消化傳代。

1.1.3 動物 BALB/c小鼠40只，雌性，4周齡，體質(zhì)量12～15 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動物中心［實驗動物質(zhì)量合格證號44002100001315，許可證號SYXK（粵）2010-0056］。全部動物實驗過程均符合動物倫理委員會相關(guān)法規(guī)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌模型的建立和鑒定 1）實驗分組：將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分成對照組：無免疫抑制+接種人乳腺癌細(xì)胞；低劑量組：低劑量免疫抑制+接種人乳腺癌細(xì)胞；中劑量組：中劑量免疫抑制+接種人乳腺癌細(xì)胞；高劑量組：高劑量免疫抑制+接種人乳腺癌細(xì)胞。2）小鼠免疫抑制處理：實驗的第1d，低、中、高劑量組小鼠分別腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg。第2d，低、中、高劑量組腹腔分別注射甲基強(qiáng)的松龍50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg，之后連續(xù)3 d，3組小鼠腹腔注射青霉素8萬IU/只，預(yù)防感染。第2周再進(jìn)行1次上述操作。對照組小鼠同時間予以腹腔注射等體積的生理鹽水。3）小鼠乳腺癌動物模型制備和處理：人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自上海細(xì)胞生物研究所。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)＞95%，使用1×PBS液清洗3次，再用1×PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL，制備成細(xì)胞懸液放在4℃冰上備用。第3周于4組小鼠的背部接種細(xì)胞懸液0.2 mL/只，接連注射5 d。4）觀察指標(biāo)：腫瘤細(xì)胞接種后，每天觀察小鼠食欲及活動度，同時觀察記錄小鼠成瘤時間、腫瘤形態(tài)和腫瘤潰瘍出現(xiàn)的時間。每周測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)腫瘤體積公式［3］V=1/2×a×b2，計算出腫瘤的體積。第8周小鼠禁食不禁水24 h，次日用水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，鼠尾靜脈注射18F-FDG 0.2 mci/只，注射50 min之后進(jìn)行PET/CT掃描。第9周脫頸處死荷瘤鼠，完整取出腫瘤組織，記錄腫瘤的質(zhì)量、質(zhì)地、浸潤以及壞死程度。腫瘤組織和心、肺、肝、腎、脾進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片和HE染色，光鏡觀察。對于實驗過程中死亡的小鼠，于死亡當(dāng)天進(jìn)行上一步操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況和死亡率

第4周開始，高、中劑量組與對照組比較，小鼠食欲不佳，活動度減少，但體質(zhì)量無明顯差異。低劑量組和對照組比較，食欲、活動度、體質(zhì)量無明顯差異（表1）。高劑量組分別有2只小鼠死于第7周和第8周，死亡率達(dá)40%。中劑量組有1只小鼠死于第8周，死亡率為10%。

2.2 成瘤時間、成瘤率與移植瘤性質(zhì)

中劑量組和高劑量組接種成功率分別為60%（6/ 10只）和80%（8/10只），對照組和低劑量組均無小鼠成瘤。高劑量組在種植后4～6 d即可觸及腫瘤，中劑量組在種植后8～10 d可觸及腫瘤。兩組移植瘤形態(tài)都較規(guī)整，多為圓形。高劑量組小鼠潰瘍出現(xiàn)較早（第7周），中劑量組潰瘍出現(xiàn)時間較晚（第8周）。中劑量組雖然成瘤時間較晚，但移植瘤的壞死較少，更適合PET/CT顯像（圖1）。

表1 不同時間小鼠體質(zhì)量和移植瘤體積Table 1 Body weight and tumor volume of mice at different times

圖1 中劑量組和高劑量組小鼠PET/CT顯像Figure 1 Positron emission tomography-computed tomography images in the medium dose and high dose groups

2.3 移植瘤體積與生長曲線

比較高劑量組和中劑量組各時期移植瘤的體積可以看出，雖然成瘤的時間不同，但兩組移植瘤的生長曲線較相似（表1、圖2）。

圖2 移植瘤生長曲線Figure 2 Growth curves of the transplanted tumors

2.4 病理學(xué)檢查

2.4.1 大體檢查 取出的瘤體大致呈圓形，高劑量組種植瘤表面可見潰瘍，質(zhì)地較軟，中央壞死多。中等劑量組瘤體較硬，中央壞死較少，表面潰瘍較少見。高劑量組的8只荷瘤鼠有3只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移（共3個轉(zhuǎn)移病灶），2只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（共2個轉(zhuǎn)移病灶），1只發(fā)生脾轉(zhuǎn)移（共1個轉(zhuǎn)移病灶）。中劑量免疫抑制組的6只荷瘤鼠有2只出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移（共2個轉(zhuǎn)移病灶），1只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（共1個轉(zhuǎn)移病灶），未見脾轉(zhuǎn)移。兩組成瘤后出現(xiàn)主要臟器轉(zhuǎn)移的情況無顯著性差異（表2）。

2.4.2 光鏡檢查 低劑量組和對照組未見癌組織，高劑量組和中劑量組的癌組織在光鏡下可見細(xì)胞大小形態(tài)不一，核大深染，異形性明顯，呈巢狀、腺管狀或雜亂排列，并伴有壞死（圖3）。鏡下觀察腫瘤組織、壞死面積占切片總面積的5%～25%，記1分；壞死面積占切片總面積的26%～50%，記2分。高劑量組8例組織中，有1例記為1分，7例記為2分。中劑量組6例組織中，5例記為1分，1例記為2分。高劑量組得分比中劑量組明顯較高（P＜0.05，表2）。

圖3 MDA-MB-231乳腺癌移植瘤（HE×100）Figure 3 Pathological sections of the transplantated tumors（HE×100）

表2 小鼠內(nèi)臟轉(zhuǎn)移情況和鏡下移植瘤壞死面積Table 2 Visceral metastasis of mice and tumor necrosis observed by microscopy

3 討論

動物模型的建立對早期診斷、病因、發(fā)病機(jī)制、基因治療以及臨床干預(yù)之后的療效隨訪中有極其重要的價值［4-8］。

在國內(nèi)外開展的人源性乳腺癌動物模型多采用裸鼠，技術(shù)較成熟，成瘤率高，操作較簡單，研究較深入。裸鼠模型固然有不可比擬的優(yōu)點，但也表現(xiàn)出費用高、生長環(huán)境要求高、食物和水都需要嚴(yán)格的消毒、壽命短等缺點。本實驗則采用環(huán)磷酰胺和強(qiáng)的松抑制具有正常免疫功能的BALB/c小鼠，再注射乳腺癌細(xì)胞懸浮液進(jìn)行模型構(gòu)建。雖技術(shù)操作方面較為復(fù)雜，但在長期試驗中，此種模型可表現(xiàn)出對腫瘤的免疫反應(yīng)，更好的模仿乳腺癌在免疫正常的機(jī)體里的發(fā)生、發(fā)展過程，并且此種模型生存期長，耐受力強(qiáng)，對于需要長期實驗以及后續(xù)治療展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。1980年，Steel等［9］提出對免疫功能正常的動物進(jìn)行輕度的免疫抑制，從而耐受人癌細(xì)胞，制備荷瘤鼠模型。Akhte等［10］使用適當(dāng)?shù)沫h(huán)孢素A對SD大鼠進(jìn)行輕度免疫抑制，將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29懸液注入大鼠腹腔，可成功制備出腹膜轉(zhuǎn)移癌動物模型。

目前國內(nèi)外可用于建立乳腺癌動物模型的方法大概有以下4種：自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、轉(zhuǎn)基因和基因敲除性。其中移植法是現(xiàn)在實驗室多采用的建立乳腺癌動物模型的方法，其制作的動物模型具有周期短、成本低、成瘤率高、腫瘤的生長速度較一致、個體差異較小等優(yōu)點［11-13］。目前，因非激素依賴性腫瘤治療方法較局限［11］，本實驗采用MDA-MB-231細(xì)胞為非激素依賴性腫瘤提供新的研究途徑。在預(yù)實驗過程中，一次性注射1×108/mL細(xì)胞后，小鼠在未成瘤之前多死亡。與文獻(xiàn)有所出入，對本實驗進(jìn)行改進(jìn)，將1×108/mL細(xì)胞分次注射，分成2、3、4、5次進(jìn)行注射，最后發(fā)現(xiàn)分5次注射，可以控制在成瘤之前無小鼠死亡，且腫瘤的形態(tài)和大小與1次性注射1×108/ mL細(xì)胞無明顯差異。故采用分5次注射，每天小鼠注射0.2 mL/只，濃度為1×108/mL細(xì)胞。至于一次性注射1×108/mL細(xì)胞死亡率高的原因是否因為在接受細(xì)胞注射之前進(jìn)行了環(huán)磷酰胺和強(qiáng)的松處理，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的實驗和論證。為研究成瘤和免疫抑制劑的劑量關(guān)系，本實驗將小鼠隨機(jī)分成4組，分別對4組小鼠予以低、中、高劑量的免疫抑制和生理鹽水。實驗結(jié)果表明，高劑量組小鼠成瘤率最高，但小鼠死亡率最高，達(dá)40%（4/10）；中劑量組小鼠成瘤率次之，小鼠死亡率較高劑量組明顯降低，但僅有1只小鼠在實驗過程中死亡。對照組和低劑量免疫抑制組無小鼠成瘤，亦無小鼠死亡。

在臨床工作中，PET/CT主要用于腫瘤、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面的疾病。由于科學(xué)家在對某種疾病的認(rèn)識和研究過程中，逐步意識到動物模型的建立對于了解疾病的發(fā)生、發(fā)展及其演變有著舉足輕重的地位，因此PET/CT在小動物領(lǐng)域的研究也逐步展開［14-15］。本實驗小鼠PET/CT顯像提示中劑量組比高劑量組瘤體成像質(zhì)量好，強(qiáng)化更均勻，更適合于成像研究。病理學(xué)檢查是目前疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，高劑量組和中劑量組的癌組織在光鏡下細(xì)胞形態(tài)和排列無明顯差別，但高劑量組瘤體組織壞死面積較大。不論是從PET/CT，還是病理學(xué)觀察，都能表明本實驗可成功制備出人乳腺癌小鼠移植模型。總之各種動物模型都有其適用范圍，每個研究者必須根據(jù)自己的實驗?zāi)康?，一方面致力于建?gòu)新的更方便更符合實驗要求的模型，另一方面對己有模型繼續(xù)研究加以改進(jìn)，制備出最適合自己實驗的動物模型。

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（2013-11-15收稿）

（2014-03-05修回）（本文編輯：賈樹明）

Cyclophosphamide and prednisone established a human breast carcinoma model in mice

Jian JI,Minfeng LIU,Yipeng YANG,Zhaoze GUO,Jianyu DONG,Changsheng YE

Changsheng YE;E-mail:yechsh2006@126.com
Department of Breast Surgery,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Objective:This study aimed to establish a mouse model of breast cancer by inoculating human breast cancer cells into mice with normal immune function.Methods:Forty female BALB/C mice were randomized into four groups,with 10 mice in each group. The four groups were established according to the dosage of cyclophosphamide and prednisone,namely,the control group,low dose group, medium dose group,and high dose group.The mouse models of breast cancer were established by injecting human breast cancer cells into the fat pad of the right second breast of mice in the groups.Mice in the four groups were observed based on the time of tumorigenesis,rate of tumor formation,tumor imaging and pathological features,and metastasis of vital internal organs.Results:In the high dose group,the time of tumor formation was lower than that of the other groups,but the rate of tumor formation was high.Some visceral metastases occurred in the mice.By contrast,the medium dose group revealed completely opposite results.No death and tumor formation in both the control and low dose groups were reported.Conclusion:Ahuman breast carcinoma model in mice was successfully established.Using this model,the onset and development of breast cancer could be much better imitated in the normal immune system of mice.

cyclophosphamide,prednisone,immune suppression,breast neoplasm,animal model,positron emission tomography-computed tomography

10.3969/j.issn.1000-8179.20131920

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院乳腺科（廣州市510515）

*本文課題受廣東省科技計劃基金項目（編號：2012B010300013）資助

葉長生 yechsh2006@126.com

This work was supported by a grant from the Guangdong Provincial Funds of Science and Technology Projects(No.2012B010300013)

嵇健 在讀碩士研究生。研究方向為乳腺腫瘤疾病。E-mail：irisjijian@163.com