脫基因毒性乳酸菌的篩選

張明，孫二娜

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院教育部功能乳品實驗室，北京100083；3.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；4.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048）

基因毒性是指能直接或間接損傷DNA 的性質(zhì)?；蚨拘曰衔镏苯踊蜷g接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變或致癌作用的物質(zhì)。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinolin 1-oxide）是一種硝基芳烴類化學(xué)誘變劑和致癌物質(zhì)。由于環(huán)境中多環(huán)芳烴化合物的不完全燃燒和氮的氧化，硝基芳烴在自然界中廣泛存在，并能夠引起人類及動物細(xì)胞的基因突變[1-2]。

乳酸菌能夠通過對基因毒性物質(zhì)的吸附或轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)脫除基因毒性的目的[3]。乳酸菌對于基因毒性物質(zhì)的脫除作用也是乳酸菌預(yù)防癌癥的重要因素之一[4-5]。然而，不同種類的乳酸菌脫除基因毒性的活性有很大的不同[6-7]。Cenci 等用SOS 顯色反應(yīng)檢測了分離自乳制品的乳酸菌對4-NQO 的基因毒性抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67 株乳酸菌中有31 株菌對4-NQO 的脫基因毒性能力大于75%，抑制能力最強的菌株有：干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌等[7]。

本研究以6 個種屬（干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌）的55 株乳酸菌為基礎(chǔ)，篩選具有脫基因毒性的菌株，并分析脫基因毒性作用與菌種之間的聯(lián)系。并對具有良好脫毒效果的菌株進(jìn)行量效關(guān)系測定，探究各菌株脫毒能力與劑量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗所用乳酸菌均由北京市教育部共建功能乳品實驗室分離及保藏，共55 株。其中干酪乳桿菌5株，植物乳桿菌9 株，保加利亞乳桿菌11 株，唾液乳桿菌9 株，雙歧桿菌9 株，發(fā)酵乳桿菌11 株，鼠李糖乳桿菌1 株。

1.2 試劑

4-硝基喹啉氧化物（4-NQO）：間接致癌物，用二甲基亞砜將4-NQO 配成50 mmol/L 的溶液，-20 ℃凍存，用時使用二甲基亞砜稀釋至所需濃度。

4-羥胺基喹啉氧化物（4-HAQO）：4-NQO 的直接致癌形式，微生物可通過自身的生物轉(zhuǎn)化將4-NQO完全轉(zhuǎn)化為4-HAQO。用二甲基亞砜將4-HAQO 配成50 mmol/L 的溶液，-20 ℃凍存，用時使用二甲基亞砜稀釋至所需濃度。

1.3 菌株的培養(yǎng)

乳酸菌菌種保藏狀態(tài)部分為凍干粉，部分保藏于脫脂甘油中。干粉狀態(tài)菌種活化時，在無菌條件下，抽取部分MRS 培養(yǎng)基加入干粉瓶中，形成菌懸液。抽取菌懸液加入MRS 培養(yǎng)基中。保藏于脫脂甘油中的菌，按1%比例接入MRS 培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。而后按1%接種量傳代培養(yǎng)。使用第3 代菌株作為實驗用菌。

將各乳酸菌菌株的第三代菌株培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)液進(jìn)行離心，菌體沉淀用生理鹽水洗滌，再次離心，菌體重懸在生理鹽水中制成菌懸液。取2 mL 菌懸液加4-NQO 稀釋液制成菌體4-NQO 共培養(yǎng)物，菌體濃度1010cfu/mL 左右，4-NQO 終濃度5 mM/L。共培養(yǎng)體系橫置于振蕩培養(yǎng)箱中，在避光條件下震蕩培養(yǎng)4 h，離心取1 mL 上清液于離心管中，再次離心（10 000 r/min，2 min）。吸取上清液，進(jìn)行HPLC 分析。

1.4 HPLC 檢測程序[8]

流動相：A 相為超純水，B 相為乙腈。濃度梯度：0 min～20 min，B 相濃度10%～30%，21 min～25 min B相濃度維持90%。總流速：1 mL/min。檢測波長：355 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用高效液相色譜工作站獲得空白及樣品中4-HAQO 峰的面積。根據(jù)以下公式計算菌株對致癌物4-NQO 的清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株脫基因毒性能力測定

不同菌株脫基因毒性的測定結(jié)果如圖1 所示。

圖1 各種屬菌株清除率（圖中每一個點代表一株菌的清除率）Fig.1 The genotoxicity inhibition rate of lactic acid bacteria

試驗菌株中有18.64%（11/59）具有較好的脫基因毒性的功能，其4-NQO 的清除率在75%以上。其余菌株（48 株）4-NQO 清除率均小于30%。試驗中存在明顯脫基因毒性菌株的種屬有：唾液乳桿菌（9/9），發(fā)酵乳桿菌（2/9）。植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌四個種屬中均不存在清除率大于75%的菌株。清除率大于75%的菌株分別是唾液乳桿菌LS2（99.33%），LS3（99.47%），LS4（99.54%），LS5（99.64%），LS6（99.49%），LS7（99.73%），F(xiàn)DB81（95.78%），F(xiàn)DB86（78.35%），F(xiàn)DB88（75.14%），發(fā)酵乳桿菌M2-2（94.88%），M2-3（85.59%）。唾液乳桿菌種屬內(nèi)9 株菌全部具有較好的脫基因毒性作用。

2.2 嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)

嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖2。

圖2 嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)Fig.2 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus salivarius isolated from infant

本試驗中所篩選的唾液乳桿菌分為嬰兒腸道和長壽老人腸道兩種來源。本研究首先對嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的量效關(guān)系進(jìn)行研究。如圖2 所示，各菌株在量效關(guān)系試驗中所達(dá)到的最大清除率分別為LS2 79.37 %，LS3 48.80 %，LS4 84.34 %，LS5 28.01 %，LS6 37.00%，LS7 66.00%。嬰兒來源唾液乳桿菌組的最小有作用劑量為5×108cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，唾液乳桿菌清除率都出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。LS2，LS3，LS5，LS7 等4 株菌在5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。而LS4 在2.5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。

2.3 長壽老人來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)

長壽老人來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖3。

圖3 長壽老人腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)Fig.3 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus salivarius isolated from centenarians

各菌株在量效關(guān)系試驗中所達(dá)到的最大清除率分別為FDB81 69.02%，F(xiàn)DB86 75.73%，F(xiàn)DB88 49.40%。三株菌的來源唾液乳桿菌組的最小有作用劑量為5×108cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，唾液乳桿菌清除率都出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。FDB86，F(xiàn)DB81 等2 株菌在5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。而FDB88 在2.5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。達(dá)到最大后，隨著菌液濃度的升高，清除率呈明顯下降趨勢。

2.4 發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)

發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖4。

圖4 發(fā)酵乳桿菌的脫基因毒性的劑量效應(yīng)Fig.4 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus fermentium

從結(jié)果可以看出：發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)曲線與唾液乳桿菌有很大不同，發(fā)酵乳桿菌組的最小有作用劑量為1×107cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，發(fā)酵乳桿菌的基因毒性清除率呈上升趨勢。劑量為1×1010cfu/mL時，M2-2 的清除率達(dá)到80.83%，而M2-3 的清除率達(dá)到67.18%。唾液乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌這兩個種屬的菌，在脫除基因毒性量效關(guān)系上表現(xiàn)出了不同的特點。這種不同可能是因為兩菌種脫毒機理不同造成的。

3 結(jié)論

通過檢測菌體與致癌物4-NQO 共培養(yǎng)后致癌物質(zhì)的殘留量對菌體的脫基因毒性功能強弱進(jìn)行評價。結(jié)果表明：在選取的6 個不同種屬共計55 株乳酸菌中，有11 株乳酸菌具有較強的基因毒性脫除作用，脫除率大于75%。其中唾液乳桿菌9 株，發(fā)酵乳桿菌2株。不同種類乳酸菌脫除基因毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系和最小作用劑量不同。對于不同來源的唾液乳桿菌，劑量反應(yīng)關(guān)系基本呈先上升后下降的趨勢，最小作用劑量為5×108cfu/mL。而發(fā)酵乳桿菌隨菌懸液濃度增大，發(fā)酵乳桿菌的基因毒性清除率呈上升趨勢，而且菌體濃度在1×107cfu/mL 時既能表現(xiàn)出明顯的脫基因毒性功能。此結(jié)果也說明，不同種類的乳酸菌脫除基因毒性的過程和機理存在著一定的區(qū)別。

[1] Caldini G, Trotta F, Corsetti A, et al. Evidence for in vitro antigenotoxicity of cheese non-starter lactobacilli[J].Anton van Leeuw,2008,93:51-59

[2] Caldini G, Trotta F, Villarini M, et al. Screening of potential lactobacilli antigenotoxicity by microbial and mammalian cell-based tests[J].Int J Food Microbiol,2005,102:37-47

[3] Renner H, Musner R. The possible role of probiotics as dietary antimutagens[J].Mutat Res,1991,262:239-248

[4] Zhang M,Qiao X,Zhao L,et al.Lactobacillus salivarius REN counteracted unfavorable 4-nitroquinoline 1-oxide induced changes in colonic microflora of rats[J].J Microbiol,2011,49(6):877-883

[5] Zhang M, Wang F, Jiang L, et al. Lactobacillus salivarius REN inhibits rat oral cancer induced by 4-nitroquioline 1-oxide[J].Cancer Prev Res(Phila),2013,6(7):686-694

[6] Cenci G,Caldini G,Trotta F,et al. In vitro inhibitory activity of probiotic spore-forming bacilli against genotoxins[J].Lett Appl Microbiol,2008,46:331-337

[7] Cenci G, Rossi J, Trotta F, et al. Lactic acid bacteria isolated from dairy products inhibit genotoxic effect of 4-nitroquinolin-1-oxide in SOS chromotest[J].Syst Appl Microbiol,2002,25:483-490

[8] 王芳,姜鷺,劉愛萍,等.高效液相色譜法測定唾液乳桿菌脫基因毒性作用[J].分析化學(xué),2008(6):740-744