微波輔助提取玉米苞葉黃酮的工藝優(yōu)化

徐艷陽，陳佳麗，李科靜，林雨婷，朱志紅，吳海成

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

玉米苞葉為禾本科玉米屬一年生草本植物玉米（Zea mays L.）的外苞葉。資料記載玉米的根、葉、花柱、軸均可供藥，有調(diào)中開胃、益肺寧心、利水通淋、抗氧化和解毒去疾之功效[1-2]。我國是玉米生產(chǎn)和種植大國，玉米產(chǎn)量居世界第二位[3]，種植面積約2 449.83 萬hm2，每公頃玉米可采集苞葉600 kg，所以玉米苞葉資源十分豐富，易于收集。但是大量的玉米苞葉沒有得到有效利用。黃酮類化合物在植物中分布最廣，是天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域中研究較成熟的一類物質(zhì)，有預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏、止血鎮(zhèn)痛等功效[4-5]，被列為保健食品的一類功能因子。

目前關(guān)于玉米苞葉中黃酮類成分的提取和功能研究較少。國內(nèi)學(xué)者王艷[6]對玉米苞葉中黃酮類化合物進行了提取和鑒定。孟雪[7]等用大孔樹脂分離純化了玉米苞葉總黃酮。魯萍[7]等對玉米苞葉總黃酮的超聲提取和體外抗氧化活性進行了研究。張沐新[8]等對玉米苞葉中新黃酮類化合物進行了分離和鑒定研究。甄艷軍[9]等研究發(fā)現(xiàn)玉米苞葉水提物具有降低動脈硬化家兔血脂及防治動脈硬化的作用。微波輔助提取是近年來發(fā)展較快的一種天然產(chǎn)物提取技術(shù)，具有操作簡便、易控制、快速和提取率高等優(yōu)點，被廣泛用于天然植物中黃酮類化合物、生物堿、皂苷類等有效成分的提取[10-15]。因此本文利用微波法對玉米苞葉中黃酮類化合物的提取工藝進行研究，為玉米苞葉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米苞葉采集于長春市農(nóng)貿(mào)市場，清洗，烘干，粉碎過60 目篩，備用。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥97 %）：天津市光復(fù)精細化工研究所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉：北京化工廠生產(chǎn)；所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

FW177 型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AL104 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；LD4-2A 型雷勃爾低速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；MM721AAU-PM 美的微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；TU-1810 型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 玉米苞葉中黃酮的提取工藝

玉米苞葉→清洗→烘干→粉碎→微波處理→離心→定容→測定

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取20.00 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，得到2.00 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[13]。再用移液管準(zhǔn)確量取2.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容、搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)對照液。

1.4.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液至4.00 mL，5 %NaNO2溶液0.50 mL，10 %的Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻后靜置10 min，再加入4.00 mL 5%NaOH 溶液，用60%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，然后在510 nm 波長處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 玉米苞葉中黃酮含量的計算

采用硝酸鋁顯色法[16]測定玉米苞葉中黃酮的含量，其計算公式如下：

式中：S 為玉米苞葉中黃酮含量，（mg/g）；C 為玉米苞葉提取液中黃酮的濃度，（mg/mL）；V 為玉米苞葉提取液的體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為玉米苞葉的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗設(shè)計

1.5.1 微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，用60%乙醇溶液按料液比1 ∶10 溶解，在功率為119 W 微波爐中提取2、3、4、5、6 min，然后離心，定容到10 mL，測量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.2 乙醇濃度對玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品每份1.00 g，分別按料液比1 ∶10，加入濃度為60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液，在功率為119 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.3 料液比對玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，分別按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，加入60%乙醇溶液，在功率為119 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測量上玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.4 微波功率對玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，按料液比1 ∶10、加入60%乙醇溶液，分別在功率為119、252、385、539、700 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.6 玉米苞葉中黃酮提取條件的優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken（BBD）試驗設(shè)計進行優(yōu)化研究，各因素的水平設(shè)置及編碼見表1。

表1 試驗因素水平編碼表Table 1 Coded variables and levels of facters

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.05 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，根據(jù)回歸方程、響應(yīng)曲面圖及等高線圖分析出各因素之間交互作用的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.4.3 在510 nm 波長處測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，其結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1 可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=12.171x-0.001 3，R2=0.999 8，該方程的回歸系數(shù)較高，說明蘆丁的濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.1 中的操作方法考查微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.2 Effects of microwave time on flavonoids yield from corn bracts

由圖2 可知，隨著微波時間的延長，玉米苞葉中黃酮含量先升高后降低，當(dāng)微波時間為3 min 時，玉米苞葉中黃酮含量最高。其原因可能為當(dāng)微波時間大于3 min 時，提取液體積損失較多，同時有部分玉米苞葉中黃酮類物質(zhì)被氧化，因此微波時間選擇3 min 為宜。

2.2.2 乙醇濃度對玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.2 中的操作方法考查乙醇濃度對玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on flavonoids yield from corn bracts

由圖3 可知，隨著乙醇濃度的增加，玉米苞葉中黃酮含量逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達到80%時，黃酮含量最高，當(dāng)乙醇濃度大于80%后，黃酮的含量降低，其原因可能為當(dāng)乙醇濃度大于80%后，玉米苞葉中脂溶性物質(zhì)溶出增多，干擾了黃酮類物質(zhì)的提取和檢測。但是由于脂溶性物質(zhì)溶出增多給玉米苞葉中黃酮的純化帶來了較大的麻煩，從成本和黃酮含量的角度綜合考慮，乙醇的濃度選擇80%較佳。

2.2.3 料液比對玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.3 中的操作方法考查料液比對玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.4 Effects of Solid-Liquid ratio on flavonoids yield from corn bracts

由圖4 可知，當(dāng)料液比為1 ∶20 時，玉米苞葉中黃酮含量最高，其原因可能為當(dāng)料液比大于1 ∶20時，玉米苞葉中雜質(zhì)溶出較多。從增加提取率和減少溶劑用量節(jié)約成本等方面綜合考慮，料液比選擇1 ∶20較合適。

2.2.4 微波功率對玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.4 中的操作方法考查微波功率對玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖5。

圖5 微波功率對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.5 Effects of microwave power on flavonoids yield from corn bracts

由圖5 可知，隨著微波功率的增大，玉米苞葉中黃酮含量呈下降趨勢，其原因可能為當(dāng)微波功率過大即超過539 W 后提取液容易產(chǎn)生爆沸，損失較大。因此微波功率選擇252 W 為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化及分析

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗

以微波時間、乙醇濃度、料液比和微波功率為影響因素，應(yīng)用BBD 響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化玉米苞葉中黃酮的提取條件，方差分析結(jié)果見表2～表3。

由表2 可知，設(shè)立了5 個中心試驗點即零點來估計試驗誤差。利用Design-Expert 8.0.5 軟件建立響應(yīng)面二次回歸模型，以玉米苞葉中黃酮含量為響應(yīng)值Y（%），經(jīng)二次回歸擬合后得到回歸方程為：

該方程的回歸系數(shù)為R2=0.902 1，因此可以用該回歸方程來表示各因素值和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。最佳理論預(yù)測條件為：微波時間4 min、乙醇濃度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮含量可達到0.613（mg/g）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Results of Response surface design

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA of regression model

表3 中微波時間、乙醇濃度、料液比和微波功率的一次項均達到了顯著水平（P＜0.05）；在二次項中，乙醇濃度和微波功率對試驗結(jié)果的影響顯著；在交互相中，微波時間和乙醇濃度的交互作用及微波時間和料液比的交互作用對玉米苞葉中黃酮含量有顯著性影響，而其它因素的交互作用影響不顯著。由表3 可看出，模型的顯著水平為極顯著，方程的失擬項不顯著，說明該回歸模型是可靠的，因此可以用該回歸模型對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖形分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對應(yīng)于試驗因素A、B、C 和D 所構(gòu)成的三維空間曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，響應(yīng)面圖形可以直觀地反映各因素及他們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響[17-18]。對交互作用顯著的響應(yīng)面圖形進行分析，結(jié)果見圖6 和7。

由圖6 可以看出，玉米苞葉中黃酮含量隨微波時間的增大而升高；隨乙醇濃度的增加先增大后減小。微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響顯著。與微波時間相比，乙醇濃度對黃酮含量的影響不太顯著，且隨其數(shù)值的增加或減少響應(yīng)值的變化較小。由圖7 看出，玉米苞葉中黃酮含量隨微波時間的增大而升高；隨料液比的增加而降低。微波時間對玉米苞葉中黃酮含量的影響顯著。與微波時間相比料液比對黃酮含量的影響不太顯著，且隨料液比的增加或減少響應(yīng)值的變化較小。

圖6 微波時間和乙醇濃度交互作用對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.6 Effects of microwave time and ethanol concentration interaction on flavonoids yield from corn bracts

圖7 微波時間和料液比交互作用對玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.7 Effects of microwave time and Solid-Liquid rate interaction on flavonoids yield from corn bracts

2.3.4 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證

由二次回歸方程得玉米苞葉中黃酮提取工藝的最佳理論預(yù)測條件為：微波時間4 min、乙醇濃度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮提取率為0.613 mg/g。為了檢驗預(yù)測結(jié)果與實際情況是否一致，考慮到實際情況，最佳工藝條件修正為：微波時間4 min、乙醇濃度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此條件下進行五次驗證試驗，得到玉米苞葉中黃酮含量為（0.586±0.024）mg/g，與預(yù)測值基本相符，說明該二次回歸方程與實踐情況擬合較好。

3 結(jié)論

1）研究微波時間、乙醇濃度、料液比和微波功率對玉米苞葉中黃酮含量的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計得到影響玉米苞葉中黃酮含量的因素順序為：微波功率＞微波時間＞料液比＞乙醇濃度，且對玉米苞葉中黃酮含量的影響均顯著。

2）以玉米苞葉中黃酮含量為Y（%），經(jīng)二次回歸擬合得到的回歸方程為：

Y（%）=0.52+0.03A+0.02B-0.02C+0.03D+0.03AB-0.02AC+0.01BC+0.01BD+0.01A2-0.04B2-0.02C2-0.02D2（R2=0.9021）

3）利用Design-Expert 8.0.5 軟件建立響應(yīng)面二次回歸模型，得出微波提取玉米苞葉中黃酮的最佳工藝條件為：微波時間4 min、乙醇濃度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮含量為（0.586±0.024）mg/g，與理論預(yù)測值基本相符，可為玉米苞葉中黃酮類化合物的工業(yè)提取工藝研究提供參考。

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