內(nèi)蒙古奶豆腐中潛在益生性乳酸菌的篩選

王 輯，顧蕓佳，馬文慧，楊貞耐,*

（1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025）

益生菌是一類活性微生物，攝取一定量時，會對宿主產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡，發(fā)揮益生作用[1]。常見的益生菌主要包括乳桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）[2]。據(jù)報道，益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、降低膽固醇、抗氧化、預(yù)防癌癥、抑制病原菌、緩解乳糖不耐癥、增強人體免疫力、緩解過敏和抑制腫瘤生長 等生理功能[3-5]。另外，益生菌的添加還可以改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)構(gòu)，形成獨特的風(fēng)味[6]。益生菌要想在人體內(nèi)發(fā)揮功能特性，前提必須保證其在胃液的酸性環(huán)境、小腸中 的膽汁鹽環(huán)境以及厭氧環(huán)境中存活下來，同時還要對 腸道細(xì)胞具有一定的黏附性。因此，在益生菌的篩選過程中，菌株的胃液耐受性、膽鹽耐受性及細(xì)胞表面疏水性是必不可少的重要評定指標(biāo)。

我國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品資源豐富，具有制作簡便、貯存時間較長、營養(yǎng)價值豐富及風(fēng)味純正等特點。此外，傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中還具有豐富的乳酸菌資源。截止到目前，已有部分乳酸菌被分離出來，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這些菌株是安全可靠的，且具有潛在的益生性及功能特性。Li Shengyu等[7]從內(nèi)蒙古奶豆腐中分離出一株產(chǎn)胞外多糖L.plantarum C88，研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的體 外抗氧化活性。張和平等[8]從新疆馬奶酒中分離得到1株L.casei Zhang，研究表明該菌株具有降膽固醇、免疫調(diào)節(jié)及抑制病原菌等生理功能。Wang Yanping[9]和Zhang Li[10]等分別從西藏靈菇中分離出1株L.plantarum MA2和L.plantarum K25，通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)2株菌均具有降低小鼠體內(nèi)膽固醇的能力。崔文明等[11]從傳統(tǒng)乳制品中分離得到1株自溶活性較強的保加利亞乳桿 菌LJJ。Bao Yan等[12]對從傳統(tǒng)乳制品中分離出到的90株發(fā)酵乳桿菌的耐酸性、胃液耐受性、膽鹽耐受性及抑菌活性進行了研究，指出發(fā)酵乳桿菌F6的益生性最好，具有潛在的應(yīng)用價值。

本研究主要通過對內(nèi)蒙古奶豆腐源乳酸菌菌株的模擬人工胃液耐受性、膽鹽耐受性、疏水性、體外降膽固醇及抗氧化活性進行測定，著力于篩選出具有潛在益生特性的優(yōu)良菌株，為今后開發(fā)新型功能性益生菌制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

內(nèi)蒙古各地區(qū)牧民自制的奶豆腐。

牛膽鹽、膽固醇、胃蛋白酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯 肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；鄰苯二甲醛、氫氧化鉀 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正己烷、冰醋酸、濃硫酸 北京化工廠；亮綠 上海捷瑞生物工程有限公司；溶菌酶 中國醫(yī)科院友誼開發(fā)公司；蛋白酶K 美國Amresco公司；PCR反應(yīng)所需相關(guān)試劑 北京鼎國生物有限公司；乳酸菌16S rDNA通用引物 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900紫外-可見分光光度計 日本日立公司；BX53F正置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；T100TM Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司；MTN-2800W氮吹儀 北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨1 0.0、牛肉膏 10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、吐溫-80 1.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸鈉5.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.054，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L乙酸調(diào)pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

MRS-THIO液體培養(yǎng)基：向100 mL MRS培養(yǎng)基中加入0.2 g 巰基乙酸鈉，待充分溶解后，用1 mol/L乙酸調(diào)pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離純化

稱取1 g內(nèi)蒙古奶豆腐樣品，加入99 mL pH 6.5無菌磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）中，充分振蕩混勻后，稀釋到10-4、10-5，取100 μL稀釋液涂布于MRS瓊脂平板上，置于37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，挑取典型單菌落，劃線分離純化。對分離所得的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。

1.4.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

提取菌株的基因組DNA進行片段擴增：采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物，正向引物：A27F：5’-AGC GGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTAC GA-3’，反向引物：A1495R：3’-GCAGAGTTCTCGGA GTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)片段長度約1 500 bp。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物委托北京鼎國生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果與國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Info rmation，NCBI）數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行比對。

1.4.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性測定

取活化好的菌液，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液（pH6.5）洗滌2次，加入5 mL PBS緩沖液（pH 6.5）制成菌懸液。取1 mL菌懸液接入含9 mL pH 3.0的模擬人工胃液（0.2 g/100 mL NaCl，0.35 g/100 mL胃蛋白酶，過濾除菌）試管中，置于37℃厭氧培養(yǎng)。分別于接種后0 h和3 h取樣，稀釋涂布于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，進行活菌計數(shù)[13]。菌株存活率計算見公式（1）[14]。

式中：N1為胃液處理3 h后活菌數(shù)（lg（CFU/mL））；N0為胃液處理0 h活菌數(shù)（lg（CFU/mL））。

1.4.4 菌株對高質(zhì)量濃度膽鹽的耐受性測定

將活化好的菌株按3%（V/V）接種量分別接種于含有0.3、0.5、1.0 g/100 mL膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定各培養(yǎng)基在560 nm波長處的吸光度（A560nm），以不添加膽鹽的培養(yǎng)基為對照，測定菌株的存活情況。

1.4.5 菌株的疏水性測定

取活化好的菌液，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，用無菌的PBS緩沖液（pH6.5）洗滌2次。緩沖液作空白對照，用緩沖液調(diào)整菌體濃度，使其A560nm值為1.00。取3 mL調(diào)整后的菌液，分別加入0.6 mL的甲苯和十六烷，渦旋振蕩，靜置分層后，取下層水相，緩沖液作空白對照，在560 nm波長處測吸光度[15]。疏水率計算見公式（2）。

式中：A0為菌液與吸附劑混勻前的吸光度；A1為菌液與吸附劑混勻后的吸光度。

1.4.6 菌株的體外降膽固醇能力測定

將活化好的菌株按3%接種量分別接種于含0.01 g/100 mL膽固醇的MRS-THIO液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集上清。采用鄰苯二甲醛比色法測定上清液中膽固醇含量[13]，并計算菌株的膽固醇降解率，見公式（3）。

式中：A0為未接菌的高膽固醇培養(yǎng)基在550 mm波長處的吸光度；A1為發(fā)酵上清液在550 mm波長處的吸光度。

1.4.7 菌株的體外抗氧化活性測定

1.4.7.1 無細(xì)胞提取液的制備

將活化好的菌株按3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，無菌PBS緩沖液（pH 6.5）洗滌3次，重懸于PBS中，調(diào)整菌液濃度至108、109、1010CFU/mL。向各濃度菌液中添加溶菌酶至質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL，37℃恒溫水浴30 min，冰浴超聲破碎菌體細(xì)胞（超聲波功率800 W，超聲波每次輻射2 s，間隔2 s，總時間15 min）至顯微鏡下觀察無完整菌體，4℃、8 000×g離心10 min，收集上清液即為無細(xì)胞提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要采用BA樓控控制的方式，通過硬接點的形式接入DDC模塊實現(xiàn)，要了解風(fēng)機盤管控制原理。風(fēng)機盤管的電氣設(shè)計情況（見圖2）不同于通常的動力設(shè)備，風(fēng)機盤管的功率較小，一般不單獨設(shè)置控制箱，電氣設(shè)計類似照明設(shè)計，單獨設(shè)置回路，且同時并接多個風(fēng)機盤管設(shè)備，設(shè)置的數(shù)量與回路功率有關(guān)，只要保持功率在合理范圍內(nèi)即可。

1.4.7.2 菌株對過氧化氫的耐受性測定

將活化好的菌株按1%接種量接種于含不同濃度（0、0.4、0.7、1.0 mmol/L）過氧化氫的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，無菌PBS緩沖液（pH6.5）洗滌3次，重懸于PBS中，于600 nm波長處測定其吸光度。

1.4.7.3 菌株清除羥自由基（?OH）能力的測定

采用Fenton法測定菌株對?OH的清除作用[15]。Fenton反應(yīng)體系：0.435 mmol/L的亮綠1 mL，0.5 mmol/L的硫酸亞鐵2 mL，3 g/100 mL的過氧化氫1.5 mL。向Fenton反應(yīng)體系中加入1 mL不同濃度菌株（108、109、1010CFU/mL）的無細(xì)胞提取液，混合均勻后，37℃恒溫水浴20 min，4℃、8 000×g離心10 min，取上清液，于624 nm波長處測吸光度。?OH清除率計算見公式（4）。

式中：A為無Fenton試劑、無樣品、有亮綠的吸光度；A0為有Fenton試劑、無樣品、有亮綠的吸光度；As為有Fenton試劑、有樣品、有亮綠的吸光度。

1.4.7.4 菌株清除DPPH自由基能 力的測定

取1 mL不同濃度的菌液（109、1010CFU/mL）加入2 mL DPPH甲醇溶液（0.5 mmol/L），混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，4℃、8 000×g離心10 min，取上清液，于517 nm波長處測吸光度，無菌水空白調(diào)零?？瞻捉M以等體積甲醇代替DPPH溶液，對照組以等體積無菌水代替菌液[16]。DPPH自由基清除率計算見公式（5）。

式中：A為空白組的吸光度；A0為對照組的吸光度；As為樣品組的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

從內(nèi)蒙古奶豆腐中共分離得到16株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株。其中桿菌2株，球菌14株。

2.2 菌株16S rDNA分子鑒定

圖1 菌株的16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoregram of 16S rDNA amplification products of the strains

對提取菌株的總DNA進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示，擴增出16 條特異的、大小約為1 500 bp的條帶。獲得的特異性片段純化后進行測序，將測序結(jié)果用BL AST進行序列同源性比對，根據(jù)比對結(jié)果可鑒定菌株到屬。其中5株菌鑒定為屎腸球菌，分別是菌株M1-1、M6-2、M7-1、M8-1和M8-2；9株鑒定為乳酸片球菌，分別是菌株M1-3、M2-1、M2-2、M3-1、M4-1、M4-2、M5-1、M5-2和M5-3；1株鑒定為植物乳桿菌（M1-2）；1株鑒定為鼠李糖乳桿菌（M6-1），結(jié)果見表1。

表1 菌株鑒定結(jié)果Table1 Identification of screened strains

2.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性

圖2 菌株在模擬人工胃液中的耐受性Fig.2 The tolerance of the strains to simulated artificial gastric juice

由圖2可知，16株菌表現(xiàn)出不同程度的模擬人工胃液耐受性。L.plantarum M1-2、L.rhamnosus M6-1、E.faecium M1-1和M6-2耐受性較好，在pH 3.0模擬人工胃液中培養(yǎng)3 h后的存活率均超過了80%，其中E.faecium M6-2的耐受性最高，存活率達(dá)到了96.90%。有10株菌的耐受性一般，存活率在60%～80%之間。而P.acidilactici M3-1和M5-3的耐受性較差，存活率僅為36.09%和49.81%。

2.4 菌株對高質(zhì)量濃度膽鹽的耐受性

小腸是人體吸收膽固醇的重要場所，同時也是乳酸菌發(fā)揮其降膽固醇作用的主要部位。正常人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量濃度在0.03～0.3 g/100 mL范圍內(nèi)波動，乳酸菌若要定殖于小腸，就必須有一定的膽汁 鹽耐受的能力。從表2可以看出，隨著膽鹽質(zhì)量濃度的升高，各菌株的生長受到不同程度的抑制，各菌株在相同膽鹽質(zhì)量濃度下的生長情況存在顯著差異。其中E.faecium M7-1、M8-1和M8-2對膽鹽的耐受性較高，而其他菌株對膽鹽的耐受性較弱。

表2 不同膽鹽質(zhì)量濃度下菌株的生長情況（以A56600 nnmm值表示）Table2 Tolerance of the strains to different concentrations of bile salts(represented by A560 nm)

2.5 菌株的疏水性

圖3 菌株的疏水性比較Fig.3 Comparison of the hydrophobicity of the strains

由圖3可知，在以甲苯和十六烷為吸附劑時，L.rhamnosus M6-1的疏水性最高，對甲苯和十六烷的疏水率分別為20.60%和22.15%，L.plantarum M1-2的疏水性較好，對甲苯和十六烷的疏水率分別為16.73%和15.58%，而其他菌株的疏水性較弱。

2.6 菌株的體外降膽固醇能力

圖4 菌株的體外降膽固醇能力比較Fig.4 Comparison of the in vitro cholesterol-reducing ability of the strains

由圖4可知，大部分菌株均有相應(yīng)降低膽固醇的能力，但其能力大小因菌株的不同有所差異。其中E.faecium M1-1、L.plantarum M1-2、P.acidilactici M1-3和M2-1的體外降膽固醇能力較高，膽固醇降解率分別為54.44%、45.56%、34.44%和42.01%。而其他菌株的降解率除了P.acidilactici M2-2為26.89%以外，均在20%以下。

2.7 菌株的體外抗氧化活性

過氧化氫作為?OH的前體參與氧化過程，是衡量菌體抗氧化活性的一個重要指標(biāo)。因此，本實驗通過分析菌株對過氧化氫的耐受情況，篩選具有抗氧化作用的益生菌株。受試16株菌在不同濃度過氧化氫中的生長狀況（以A600nm值表示）如表3所示，菌株對過氧化氫的耐受呈濃度依賴關(guān)系，多數(shù)菌株對低濃度過氧化氫（0.4 mmol/L）具有較強的耐受能力，37℃培養(yǎng)8 h后，A600nm大于1.0，而對高濃度過氧化氫（1 mmol/L）耐受能力較弱。其中L.plantarum M2-1、L.rhamnosus M6-1和E.faecium M8-2相比于其他菌株，對高濃度過氧化氫（1 mmol/L）的耐受性較強。

表3 不同過氧化氫濃度下菌株的生長情況（以A60000 nnmm值表示）Table3 Tolerance of the strains to different concentrations of hydrogen peroxide (represented by A60000 nnmm))

圖5 菌株對?OH的清除能力比較Fig.5 Comparison of the strains for scavenging activities on hydroxyl radicals

由圖5可知，不同菌株的?OH清除能力差異顯著，且菌株的清除能力呈濃度依賴關(guān)系，隨無細(xì)胞提取液濃度的增加，?OH的清除能力不斷提高。在受試的16株菌中，L.rhamnosus M6-1在1010CFU/mL時對?OH的清除能力最高，清除率為66.87%。此外，P.acidilactici M2-1、M4-2和 M5-3也表現(xiàn)出較高的?OH清除能力，在1010CFU/mL時對?OH的清除率均在50%以上。

圖6 菌株對DPPH自由基的清除能力比較Fig.6 Comparison of the strains for scave nging effects on DPPH free radicals

DPPH是一種穩(wěn)定的有機自由基，當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對顏色減退，從而檢測自由基清除情況及物 質(zhì)的抗氧化能力。由圖6可知，16株菌對DPPH自由基的清除能力差異不明顯。其中L.rhamnosus M1-2對DPPH自由基的清除能力最高，清除率為55.58%，而其他菌株的清除率也均在40%以上。此外，菌株 對DPPH自由基的清除能力與菌液濃度呈依賴關(guān)系，隨菌液濃度的增加，DPPH自由基的清除能力不斷提高。

3 討 論

奶豆腐是我國蒙古族家庭經(jīng)常食用的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，它是用生奶自然發(fā)酵，至乳清與乳酪分離后煮沸而制成[17]。奶豆腐中含有大量的乳酸菌，從中篩選具有潛在益生特性的菌株已成為目前國內(nèi)研究的熱點。本研究從內(nèi)蒙古奶豆腐中分離得到16株疑似菌株，經(jīng)革蘭氏染色、過氧化氫酶及16S rDNA鑒定，5株為屎腸球菌，9株為乳酸片球菌，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌各1株。周雨霞[18]對內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌進行了分離鑒定，認(rèn)為植物乳桿菌是該地區(qū)乳制品中的優(yōu)勢菌株。旭日花[19]也做了相似的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳酸亞種是該地區(qū)乳制品中的優(yōu)勢菌株。而本研究分離得到的16株菌中，乳酸片球菌占了56.3%，為優(yōu)勢菌群。

益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生特性的前提條件是保證其在胃液的酸性環(huán)境、腸道的膽鹽環(huán)境和厭氧環(huán)境中存活下來。人體空腹時胃液pH值一般在1.3～1.8之間，進食后上升到3.0左右或更高，食物在胃中停留約3 h。正常人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量濃度在0.03～0.3 g/100 mL范圍內(nèi)波動。本研究中，除了乳酸片球菌M3-1和M5-3以外，其余菌株均表現(xiàn)出較好的模擬人工胃液耐受性，在pH3.0的模擬人工胃液中培養(yǎng)3 h后，存活率均達(dá)到60%以上。在膽鹽耐受實驗中，屎腸球菌M7-1、M8-1和M8-2對膽鹽的耐受性較高，而其他菌株對膽鹽的耐受性較弱。

益生菌的篩選要求除了要具有耐受胃腸液的環(huán)境，還要對腸道上皮細(xì)胞具有一定的黏附性，保證其在微環(huán)境中成為優(yōu)勢菌株，有利于益生特性的發(fā)揮。有研究[20]表明，菌株的黏附性與疏水性呈正相關(guān)，疏水性高有利于菌株定殖于腸道內(nèi)。本研究中篩選得到2株疏水性較好的菌株，分別為鼠李糖乳桿菌M6-1和植物乳桿菌M1-2。Zago等[21]研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物乳桿菌具有良好的細(xì)胞表明疏水性。Tuo Yanfeng等[22]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌對HT-29細(xì)胞具有較高的黏附性。

本研究通過在培養(yǎng)基中添加膽固醇（0.01 g/100 mL），采用鄰苯二甲醛比色法測定培養(yǎng)基中膽固醇質(zhì)量濃度變化來評價菌株的體外降膽固醇能力。結(jié)果篩選出4株具有較高體外降膽固醇能力的菌株（屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1），膽固醇降解率均超過了30%。目前，有關(guān)乳酸菌的降膽固醇機理大致可分為3種：1）乳酸菌的膽鹽水解酶活性使膽鹽由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊摻Y(jié)合態(tài)，與膽固醇發(fā)生共沉淀[23]；2）乳酸菌對膽固醇的直接吸附、吸收同化[24]；3）其他機理。關(guān)于乳酸菌的降膽固醇機理之所以尚無定論，主要是因為研究中所采用的膽鹽種類和添加量，膽固醇的種類和添加量，菌種自身的特性（耐酸、耐膽鹽、降膽固醇機制），喂養(yǎng)的飼料、實驗動物以及飼喂時間不同有關(guān)。

從表2菌株對膽鹽的耐受性結(jié)果可知，屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1雖然具有較強的體外降膽固醇能力，但是這4株菌對膽鹽的耐受性均較弱。對于功能性較好而耐受性較弱的菌株，宜對菌株進行保護，如采用微膠囊化技術(shù)處理菌體，可以有效地保護菌體免受外界不良環(huán)境的影響，從而使其以活菌的形式到達(dá)人體腸道內(nèi)，發(fā)揮其益生功能。Chávarri等[25]利用海藻酸和殼聚糖將格氏乳桿菌和雙歧桿菌進行微膠囊化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株菌在模擬胃腸液中均表現(xiàn)出良好的存活能力。Brinques等[26]研究發(fā)現(xiàn)利用微膠囊技術(shù)可提高乳桿菌在酸奶冷藏期間的存活能力。許女等[27]研究發(fā)現(xiàn)微膠囊化的植物乳桿菌MA2的耐熱性和恒溫儲存性能都顯著高于未微膠囊化的菌體。

抗氧化活性是益生菌非常重要的生理功能指標(biāo)。研究表明，益生菌主要是通過耐受一定濃度O2或H2O2、清除機 體內(nèi)有害自由基（DPPH自由基、?OH和超氧陰離子自由基）、抗脂質(zhì)過氧化及產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化氫酶及過氧化氫酶）等作用發(fā)揮其抗氧化活性[28]。本研究主要通過對菌株的過氧化氫耐受性、?OH和DPPH自由基的清除能力，來評價其體外抗氧化活性。結(jié)果篩選出1株具有較強體外抗氧化活性的菌株，為鼠李糖乳桿菌M6-1。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)菌株的體外抗氧化活性與菌液濃度呈依賴關(guān)系，隨菌液濃度的增加，?OH和DPPH自由基的清除能力不斷提高。

4 結(jié) 論

本研究從內(nèi)蒙古奶豆腐中分離得到16株菌，其中9株鑒定為乳酸片球菌、5株為屎腸球菌、1株為植物乳桿菌、1株為鼠李糖乳桿菌。對這些菌株進行模擬人工胃液和膽鹽耐受性、疏水性、體外降膽固醇及抗氧化活性測定的結(jié)果表明：菌株對模擬人工胃液和膽鹽具有不同程度的耐受性，對甲苯和十六烷具有不同的疏水性；腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1的體外膽固醇降解率均超過30%；鼠李糖乳桿菌M6-1對過氧化氫的耐受性、?OH和DPPH自由基的清除能力最高。綜上所述，植物乳桿菌M1-2和鼠李糖乳桿菌M6-1具有較好的益生特性，可作為今后開發(fā)功能性產(chǎn)品的潛在益生菌資源。

[1]GUARNER F, SCHAAFSMA G J.Probiotics[J].International Journal of Food Microbiology, 1998, 39(3): 237-238.

[2]PIANO M D, MORELLI L, STROZZI G P, et al.Probiotics: from research to consumer[J].Digestive and Liver Disease, 2006, 38(Suppl 2): 248-255.

[3]FAO/WHO.Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[C]//Cordoba, Argentina: Expert consultation report, 2001.

[4]LI Jinjie, ZHANG Wen, WANG Chuan, et al.Lactococcus lactis expressing food-grade β-galactosidase alleviates lactose intolerance symptoms in post-weaning BALB/c mice[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(6): 1499-1506.

[5]ELMER G W, MARTIN S W, HORNER K L, et al.Survival of Saccharomyces boulardii in the rat gastrointestinal tract and effects of dietary fiber[J].Microbial Ecology in Health and Disease, 1999, 11(1):29-34.

[6]郭壯, 王記成, 閆麗雅, 等.益生菌Lactobacillus casei Zhang對酸奶風(fēng)味、質(zhì)地及感官特性的影響[J].中國乳品工業(yè), 2009, 37(1): 14-20.

[7]LI Shengyu, ZHAO Yujuan, ZHANG Li, et al.Antioxidant activity of Lactobacillus plantarum strains isolated from traditional Chinese fermented foods[J].Food Chemistry, 2012, 135(3): 1914-1919.

[8]張和平, 孟和畢力格, 王俊國, 等.分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中L.casei Zhang潛在益生特性的研究[J].中國乳品工業(yè), 2006, 34(4): 4-10.

[9]WANG Yanping, XU Nü, XI Aodeng, et al.Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-cholesterol diet[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84(2): 341-347.

[10]ZHANG Li, ZHANG Xue, LIU Chunhong, et al.Manufacture of Cheddar cheese using probiotic Lactobacillus plantarum K25 and its cholesterol-lowering effects in a mice model[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(1): 127-135.

[11]崔文明, 劉鷺, 張書文, 等.簡并引物法克隆保加利亞乳桿菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報, 2013(1): 33-37.

[12]BAO Yan, ZHANG Yanchao, ZHANG Yong, et al.Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products[J].Food Control, 2010, 21(5): 695-701.

[13]VINDEROLA C G, REINHEIMER J A.Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative “in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistance[J].Food Research International, 2003, 36(9/10): 895-904.

[14]GUO Zhuang, WANG Jicheng, YAN Liya, et al.in vitro comparison of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang, a potential new probiotic, with selected probiotic strains[J].LWT-Food Science and Technology, 2009, 42(10): 1640-1646.

[15]WANG Y C, YU R C, CHOU C C.Antioxidative activities of soymilks fermented with lactic acid bacteria and bifidobacteria[J].Food Microbiology, 2006, 23(2): 128-135.

[16]KAO T H, CHEN B H.Functional components in soybean cake and their effects on antioxidant activity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(20): 7544-7555.

[17]趙紅霞.蒙古族奶皮子和奶豆腐的工藝研究及營養(yǎng)價值分析[J].乳品加工, 2008(4): 40-42.

[18]周雨霞.內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳桿菌生物學(xué)特性及其益生作用的研究[D].呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[19]旭日花.通遼市牧區(qū)乳制品中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵特性和保藏性的研究[D].呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[20]趙維俊, 呂嘉櫪, 馬強, 等.嗜酸乳桿菌的表面疏水性分析[J].乳品工業(yè), 2011, 39(10): 8-11.

[21]ZAGO M, FORNASARI M E, CARMINATI D, et al.Characterization and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains isolated from cheese[J].Food Microbiology, 2011, 28(5): 1033-1040.

[22]TUO Yanfeng, ZHANG Weiqin, ZHANG Lanwei, et al.Study of probiotic potential of four wild Lactobacillus rhamnosus strains[J].Anaerobe, 2013, 21: 22-27.

[23]KIMOTO H, OHMOMO S, OKAMOTO T.Cholesterol removal from media by lactococci[J].Journal of Dairy Science, 2002, 85(12): 3182-3188.

[24]BRASHEARS M M, GILLILAND S E, BUCK L M.Bile salt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei[J].Journal of Dairy Science, 1998, 81(8): 2103-2110.

[25]CHáVARRI M, MARA?óN I, ARES R, et al.Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions[J].International Journal of Food Microbiology, 2010, 142(1/2): 185-189.

[26]BRINQUES G B, AYUB M A Z.Effect of microencapsulation on survival of Lactobacillus plantarum in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration, and yogurt[J].Journal of Food Engineering,2011, 103(2): 123-128.

[27]許女, 王艷萍, 習(xí)傲登, 等.植物乳桿菌MA2微膠囊化的研究[J].食品科技, 2011, 36(10): 17-22.

[28]王豪, 郭本恒, 王蔭榆, 等.益生菌潛在的抗衰老作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 21(4): 37-39.