地皮菜中一種新型水應(yīng)激蛋白基因的克隆表達及其抗人結(jié)腸癌細胞SW480的作用

郭松佳，單樹花，晉小婷，李宗偉，宋 莉，李卓玉,*

（1.化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，山西 汾陽 032200；3.太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030031）

腫瘤是嚴重危害人類健康的惡性疾病，抗腫瘤藥物的效果及安全性一直受到人們的廣泛關(guān)注，從天然產(chǎn)物中尋找活性成分已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物的發(fā)展戰(zhàn)略之一[1]。如白藜蘆醇對激素依賴性腫瘤有明顯的預(yù)防及治療作用，并已經(jīng)進入臨床試驗階段[2-3]；黃酮類化合物可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，并具有干預(yù)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強抑癌基因活性等功效[4-5]。由此可見，天然產(chǎn)物活性成分的開發(fā)對于腫瘤的預(yù)防及治療意義重大。

地皮菜，學(xué)名普通念珠藻（Nostoc commune Vauch.），為藍藻科念珠藻屬的片狀藻類，在全球范圍內(nèi)均可生長[6]。地皮菜是一種營養(yǎng)極高的保健野菜[7]，其中很多營養(yǎng)成分都參與了人體的正常新陳代謝和生理機能。Briones等[8]研究表明，地皮菜中蛋白質(zhì)的含量可以達到干質(zhì)量的22.8%～28.7%。此外，它還含有特殊的活性成分，如藍藻蛋白、多糖等[9-11]。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)地皮菜中的活性蛋白可以有效抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，經(jīng)分離純化及質(zhì)譜鑒定其為水應(yīng)激蛋白。在組織缺水的情況下[12-14]，普通念珠藻類合成水應(yīng)激蛋白，具有抵御干旱、維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能[15-16]。關(guān)于該蛋白的其他功能，尤其是抗腫瘤的功能，目前國內(nèi)外尚未有報道。

根據(jù)已獲得的前期數(shù)據(jù)，利用基因工程重組技術(shù)，從地皮菜中得到一種新型水應(yīng)激蛋白（recombinant water stress protein 1，Re-WSP1），并將該蛋白的基因序列公布于GenBank, 其序列號為KF 003026。將該基因克隆到原核表達系統(tǒng)中，獲得了高效表達工程菌，經(jīng)親和純化獲得Re-WSP1。體外實驗結(jié)果顯示，該蛋白對結(jié)腸癌細胞SW480的生長具有明顯的抑制作用，與從天然產(chǎn)物中獲得的水應(yīng)激蛋白具有同樣功能。因此，新型水應(yīng)激蛋白的研究可以為抗癌功能食品或藥物中間體的開發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與細胞株

E.coli DH5α、E.coli BL21、質(zhì)粒pET28a、人結(jié)腸癌細胞系SW480，人結(jié)腸正常上皮細胞FHC均為本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol、DNA Marker 大連寶生物公司；噻唑藍（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒 Omega公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑 普利萊公司；蛋白Marker Ferment公司；核酸工具酶 日本TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、Ni-NTA resin 生工生物工程（上海）股份有限公司；Caspase 3、Caspase 8多克隆抗體 Bioworld Technology公司；BSA蛋白濃度測定試劑盒及蛋白裂解液 碧云天生物技術(shù)研究所；膠片 柯達公司；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基美國Hyclone公司；胎牛血清 武漢博士德公司；其他無機鹽均為進口或國內(nèi)分析純。

Infinite F50酶標儀 瑞士Tecan公司；Gene genius凝膠成像分析系統(tǒng) 英國Syngene公司；Mastercycler personnal PCR擴增儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 地皮菜中cDNA的提取

將地皮菜組織在液氮中磨成粉末，加入Trizol液研磨。每毫升Trizol液加入0.2 mL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s。取上清液于一新離心管，每毫升上清液加0.5 mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000×g離心10 min。棄去上清液，按每毫升Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃條件下7 500×g離心5 min。小心棄去上清液，室溫或真空干燥10 min，然后將RNA 用DEPC水溶解沉淀后，于－80℃保存。吸取1 mL ddH2O到EP管中，加入2 μL地皮菜總RNA溶液，充分混勻，在Thermo Nanodrop 2000上測定260、280 nm波長處的吸光度，然后計算RNA的質(zhì)量濃度，并分析其純度。在DEPC處理過的EP管中加入約4 μg總RNA和1 μL的Oligo（dT）18primer（0.5 μg/μL），小心混勻，70℃條件下保溫5 min，立即浸入冰水中。按次序分別加入下列試劑：5 μL 5×M-MLV RT Buffer、2 μL dNTP mix（2.5 mmol/L）、1 μL RNase抑制劑 （30 U/μL），1 μL M-MLV Reverse Transcriptase，然后加DEPC水到25 μL。小心混勻，室溫離心5 s，將所有溶液收集到管底，37℃條件下保溫1 h；90℃條件下處理5 min，冰上冷卻，用于聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

1.3.2 地皮菜水應(yīng)激蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用P C R技術(shù)，并在W S P的N端添加6個組氨酸的His標簽設(shè)計引物，上游引物引入BamHⅠ限制性酶切位點，下游引物引入XhoⅠ限制性酶切位點，引物設(shè)計如下，上游引物：5’-CGCGGATCC ATGGCTCTTTACGGCT-3’（BamHⅠ），下游引物：5’-CCGCTCGAG TTATTCATTAACAATCGT- 3’（XhoⅠ），引物由TaKaRa公司合成。以地皮菜cDNA為模板，擴增WSP基因片段，PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA序列測定，并和表達載體pET28a分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后回收的WSP DNA和pET28a按物質(zhì)的量比3∶1的比例混合，用T4 DNA Ligase 37℃連接2 h，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細菌中，鋪在含有卡那霉素的瓊脂平板上倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，挑取顆粒飽滿的單克隆菌落至5 mL LB培養(yǎng)基，37℃條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后進行菌液PCR和酶切鑒定。

1.3.3 WSP的基因序列測定及其表達

擴增、提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。PCR產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒測序結(jié)果顯示100%相同，通過序列同源性比對和蛋白保守序列分析，鑒定為一種新的水應(yīng)激蛋白基因序列，該蛋白的基因序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank，序列號為：KF003026。將測序鑒定后的WSP-pET28a表達載體轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細菌中，挑取單克隆菌落接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的原核表達菌按照體積比1∶100的接種到含有卡那霉素的400 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，在600 nm波長處測定溶液的吸光度A600nm至0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，同時設(shè)不添加IPTG的對照組，誘導(dǎo)表達4 h，于4℃、8 000 r/min離心15 min收集細菌。將細菌溶于裂解緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，pH 7.4）中，超聲破菌，離心收集上清，樣品分別加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃條件下煮5 min，12% SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，電泳結(jié)束后考馬斯亮藍染色20 min，洗脫液（含40%甲醇和10%冰乙酸），脫色后觀察分析。

1.3.4 Re-WSP1的純化和脫鹽濃縮

采用親和層析的方法純化目的蛋白，將5 mL預(yù)裝填料Ni-NTA親和材料加到空柱子中，待其沉降后加入冰預(yù)冷的結(jié)合緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 7.4）15 mL平衡柱子。將50 mL菌體破碎、離心后的上清用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液加到層析柱中進行親和純化。用15 mL冰預(yù)冷的結(jié)合緩沖液洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，再用冰預(yù)冷的15 mL含300 mmol/L咪唑的洗脫溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）過夜透析（透析用的透析袋的規(guī)格為MD34，截留分子質(zhì)量為3 kD），加入l0 kD超濾管中，4℃、3 800 r/min離心30 min，最終獲得脫鹽并濃縮的蛋白溶液，保存于－80℃。以SDS-PAGE電泳檢測上述步驟收集的樣品中是否含有目的蛋白，同時以未誘導(dǎo)的菌懸液作為對照。

1.3.5 MTT法檢測Re-WSP1對結(jié)腸癌細胞SW480生長的影響

采用MTT法，將處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌SW480細胞、人正常結(jié)腸上皮FHC細胞，以8×103個/孔傳入96 孔培養(yǎng)板，37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/μL的Re-WSP1，每組設(shè)5個復(fù)孔，并用PBS緩沖液作為對照。孵育48 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用 PBS洗滌2次后加入新的培養(yǎng)基，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔A570nm值。

1.3.6 細胞凋亡及半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）檢測

取對數(shù)生長期細胞接種于12 孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)12 h后設(shè)對照組（不添加Re-WSP1），0.08 μg/μL Re-WSP1處理12 h組和0.08 μg/μL Re-WSP1處理24 h組，每組設(shè)4個復(fù)孔。24 h后每孔加入500 μL免疫染色固定液固定2 h，棄去固定液，每孔加入100 μL DAPI染色液避光染色15 min，激光共聚焦顯微鏡（60×）觀察細胞核形態(tài)的變化并拍照。同時隨機挑選5個視野，計算細胞凋亡率。

人結(jié)腸癌細胞SW480以4×105個/mL細胞密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后，加入Re-WSP1至終濃度為0.08 μmol/L，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，Western blotting檢測Re-WSP1是否引起SW480細胞內(nèi)Caspase蛋白表達量發(fā)生變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼WSP基因片段的擴增、克隆與鑒定

圖1 WSP PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of water stress protein

圖2 表達質(zhì)粒pET28a-WSP雙酶切電泳圖Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the expression plasmid pET28a-WSP

以地皮菜組織cDNA做模板，根據(jù)天然蛋白測序結(jié)果設(shè)計特定的引物，通過PCR擴增出WSP基因片段（約1 000 bp）（圖1）。將地皮菜WSP的PCR產(chǎn)物克隆到pET28a中，得到重組質(zhì)粒pET28a-WSP。經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠電泳圖顯示有5 369 bp和1 000 bp兩個條帶，與pET28a和WSP基因大小相吻合（圖2）。對PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒pET28a-WSP進行測序，兩者結(jié)果完全相同，基因全長1 014 bp，編碼氨基酸337個（圖1），表明載體構(gòu)建成功。該基因及蛋白序列已公布于GenBank，序列號為KF003026。

2.2 Re-WSP1的表達、純化

圖3 Re-WSP1表達及SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of Re-WSP1 by SDS-PAGE

將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，獲得原核表達工程菌pET28a-WSP/BL21。IPTG誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE結(jié)果顯示：不加IPTG誘導(dǎo)時，融合表達載體pET28a-WSP不表達目的蛋白；IPTG誘導(dǎo)后，菌株大量表達Re-WSP1蛋白，表達后目的蛋白以可溶性形式存在，分子質(zhì)量約40 kD，與理論值相符（圖3）。蛋白經(jīng)Ni-NTA純化后，獲得高純度的Re-WSP1蛋白，經(jīng)IMAGE J軟件分析其純度在90%以上。在595 nm波長處檢測Re-WSP1質(zhì)量濃度，計算出400 mL菌液得到脫鹽、濃縮的純化蛋白總量1.236 mg。

2.3 Re-WSP1對結(jié)腸癌細胞SW480的生長抑制作用

由圖4可知，用純化后不同質(zhì)量濃度的Re-WSP1分別處理結(jié)腸癌上皮細胞SW480和正常腸上皮細胞FHC 48 h。MTT法檢測SW480和FHC細胞增殖活力，結(jié)果表明Re-WSP1在質(zhì)量濃度為0.08 μg/μL和0.10 μg/μL作用48 h后，對SW480細胞生長具有明顯的抑制（P＜0.01），抑制率分別為58.2%和59.7%；而對人正常結(jié)腸組織上皮細胞FHC生長無明顯影響。

圖4 Re-WSP1對SW480和FHC細胞增殖的影響Fig.4 Effects of Re-WSP1 on the growth of SW480 and FHC cells in vitro

2.4 Re-WSP1誘導(dǎo)細胞凋亡結(jié)果

用0.08 μg/μL Re-WSP1作用于SW480細胞，并分別于12、24 h對SW480細胞進行DAPI染色，觀察SW480細胞核的變化。由圖5可知，與對照組相比，經(jīng)Re-WSP1作用12 h后，SW480細胞核出現(xiàn)固縮，有一部分細胞核呈半月形；經(jīng)Re-WSP1作用24 h后，細胞核出現(xiàn)了典型的凋亡小體，SW480細胞凋亡率為27.3%。Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)Re-WSP1（0.08 μg/μL）處理24 h后，SW480細胞內(nèi)Procaspase-3、Procaspase-8蛋白被激活，Caspase-3、Caspase-8剪切片段的量顯著增加（圖6），經(jīng)灰度分析Re-WSP1處理組與對照組相比，Cleaved-caspase-8/Caspase-8和Cleaved-caspase-3/Caspase-3顯著升高。提示Re-WSP1可能是通過激活Caspase而誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生凋亡。

圖5 Re-WSP1誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細胞發(fā)生凋亡Fig.5 Effects of Re-WSP1 on apoptosis in SW480 colon cancer cells

圖6 Re-WSP1誘導(dǎo)SW480細胞Caspase蛋白表達的變化Fig.6 Effects of Re-WSP1 on the expression of caspases in SW480 cells

3 討 論

本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，地皮菜（Nostoc commune Vauch.）中的天然水應(yīng)激蛋白能夠通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡而抑制其增殖。在此基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)將地皮菜水應(yīng)激蛋白基因片段克隆到原核表達系統(tǒng)并獲得工程菌pET28a-WSP/BL21。目的蛋白在宿主菌中獲得大量表達，并以可溶性狀態(tài)存在，純化后純度高于90%。整個制備過程簡單高效，無需復(fù)雜的處理，消耗試劑的種類均很少，為后續(xù)開發(fā)與生產(chǎn)提供了可能。

圖4實驗結(jié)果表明，Re-WSP1能夠抑制結(jié)腸癌細胞SW480細胞的增殖，而對于正常結(jié)腸上皮細胞FHC生長無明顯抑制作用。同時還發(fā)現(xiàn)，Re-WSP1可以引起SW480細胞的凋亡，該過程伴隨著凋亡細胞一系列的典型改變，包括細胞的核質(zhì)固縮，產(chǎn)生凋亡小體等（圖 5）。半胱天冬酶（caspase）依賴途徑是細胞凋亡的經(jīng)典途徑[17]，圖6實驗結(jié)果說明Re-WSP1可以通過Caspase依賴途徑誘導(dǎo)SW480細胞凋亡，地皮菜Re-WSP1處理后，上游的Procaspase-8被激活，活化的Caspase-8進一步激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞的凋亡。以上結(jié)果表明，Re-WSP1能夠通過誘導(dǎo)SW480細胞的凋亡而抑制其增殖。對Re-WSP1抗腫瘤作用機制的深入研究，有利于進一步尋找Re-WSP1抑制結(jié)腸癌細胞的作用靶點，提高其療效，同時也可以為其他抗腫瘤藥物的篩選提供新的思路。

本實驗成功獲得了一種新型的Re-WSP1。實驗結(jié)果顯示，該蛋白可以誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生凋亡,進而抑制結(jié)腸癌SW480細胞的增殖，但它對人正常結(jié)腸癌上皮細胞卻無明顯抑制作用。該蛋白究竟是通過何種分子機制實現(xiàn)這一功能，作用于細胞的靶點是什么，還需要進一步的深入探討。未來本課題組將對該蛋白進行截短優(yōu)化，應(yīng)用動物模型進行體內(nèi)實驗，以期獲得在體內(nèi)抑癌效果高，免疫反應(yīng)小，安全性高的活性肽[18-20]，為后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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