電針曲池與上巨虛穴對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB及HMGB1表達的影響

楊璐佳，張 泓 *，張雨辰 ，鄧石峰，王珍珍 ，粟艷梅

（1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

電針曲池與上巨虛穴對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB及HMGB1表達的影響

楊璐佳1，張 泓1*，張雨辰2，鄧石峰1，王珍珍1，粟艷梅1

（1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

目的 觀察電針潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）大鼠大腸經(jīng)經(jīng)合穴“曲池”、下合穴“上巨虛”后對核因子-κB((nuclearfactorκB，NF-κB)、高遷移率族蛋白 1(high mobility group box 1， HMGB1)表達的影響。 方法 以 2-4-6 三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液灌腸誘導建立SD大鼠UC模型，曲池組與上巨虛組造模成功后分別電針曲池穴和上巨虛穴，連續(xù)治療10 d，第11天處死所有大鼠，肉眼觀察大鼠結(jié)腸潰瘍評分,提取結(jié)腸組織檢測其NF-κB、HMGB1的表達。結(jié)果 造模成功后，模型組大鼠結(jié)腸肉眼潰瘍評分、結(jié)腸組織NF-κB、HMGB1表達均明顯增高（P<0.01）；電針治療后，上巨虛組降低潰瘍評分（P<0.01），曲池組、上巨虛組均能降低NF-κB、HMGB1在結(jié)腸中的表達（P<0.01）；與曲池組相比，上巨虛組潰瘍評分及NF-κB、HMGB1表達均明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 電針對UC的治療作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB、HMGB1等來實現(xiàn)的；電針上巨虛的治療作用優(yōu)于曲池，說明“上巨虛”存在相對特異性，部分證實“合治內(nèi)府”中的“合”主要應(yīng)指下合穴，其具體內(nèi)涵仍需進一步研究。

潰瘍性結(jié)腸炎；電針；核因子-κB；高遷移率族蛋白1；大鼠；曲池；上巨虛

《靈樞·邪氣臟腑病形》記載：“滎輸治外經(jīng),合治內(nèi)府”，“治內(nèi)府奈何？取之于合”。這些理論成為后世合穴臨床應(yīng)用的基本指導原則。然對于手足六陽經(jīng)而言，有上、下合穴之分，即通常所指的“經(jīng)合穴”與“腑合穴”。合治內(nèi)府之“合”是特指某一類合穴還是包括了上、下合穴？迄今為止相關(guān)醫(yī)籍或文獻均未有明確答案，借用現(xiàn)代技術(shù)對這一理論的系統(tǒng)性研究也很少。本文以潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）大鼠為研究對象，以電針曲池、上巨虛為干預手段，觀察電針對UC大鼠結(jié)腸組織中高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)、核因子-κB((nuclearfactorκB,NF-κB)表達的影響，初步探討電針手陽明大腸經(jīng)上、下合穴曲池與上巨虛對UC可能的治療機制及“合治內(nèi)府”的部分內(nèi)涵，也為臨床應(yīng)用合穴治療腑病提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量260～300 g。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。（動物及飼料由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證編號：4304701041）。所有大鼠適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)5 d后，按性別、體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、曲池組、上巨虛組，每組10只。實驗過程中對動物的處置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》[1]相關(guān)動物倫理學標準的條例。

1.1.2 主要試劑 2-4-6三硝基苯磺酸（美國sigma公司），即用型SABC免疫組化染色試劑盒、棕黃色DAB顯色劑（武漢博士德公司），NF-κB多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），HMGB1抗體試劑盒（南京建成生物科技有限公司）等。

1.1.3 主要儀器 SDZ-V型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，毫針（規(guī)格0.3×25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠），全套手術(shù)器械、CBV-1500A型無菌工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司），Motic Tek3.1圖像采集系統(tǒng)（廈門產(chǎn)），Bx-70顯微鏡成像系統(tǒng)（日本OLYMPUG公司）等。

1.2 造模方法

空白組以生理鹽水替代2-4-6三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液造模，不另處理，其余組參照文獻[2]進行造模：造模前大鼠禁食不禁水24 h，以25%烏拉坦腹腔注射麻醉（0.5 mL/100 g），用大鼠灌胃針頭輕輕從肛門插入，深度8 cm，用注射器注入含30 mg三硝基苯磺酸（即2.5%TNBS 0.6 mL）的50%乙醇溶液0.85 mL,并迅速捏緊肛門（防止液體溢出），5 min后仰臥歸籠。待其清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。觀察大鼠造模后有無出現(xiàn)懶動、拱背、厭食、大便次數(shù)增多、便軟或稀、大便末端有黏液等表現(xiàn)，有1項記1分，無記0分并累計總分，2分及以上提示造模成功。

1.3 治療方法

1.3.1 處理方法 造模成功后第二天開始:空白組不予處理；模型組捆綁固定，不予治療；曲池組捆綁固定后，取雙側(cè)曲池穴進行電針治療；上巨虛組捆綁固定后，取雙側(cè)上巨虛穴進行電針治療。每次干預時間為30 min,每天1次，連續(xù)10 d。

1.3.2 穴位定位及針刺方法 根據(jù)由華興邦[3]等制定的《實驗動物穴位圖譜》和李忠仁[4]主編的《實驗針灸學》及擬人對照法定位:曲池穴取雙側(cè)前肢橈骨近端肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中，直刺4 mm；上巨虛穴取雙側(cè)后肢上足三里穴下約5 mm處，直刺7 mm。

1.3.3 電針參數(shù) 針刺各穴位并捻轉(zhuǎn)有緊滯感后以針柄鏈接SDZ-V型華佗牌電針治療儀，參數(shù)為疏密波（10/50 Hz），左正右負，以肢體出現(xiàn)震顫為度。

1.4 標本采集與測定方法

1.4.1 標本采集 治療10 d后，第11天用25%烏拉坦按0.5 mL/100 g將大鼠麻醉，沿腹正中線打開腹腔，從腸近端至遠端取200 mg結(jié)腸組織（約長5 cm），沿腸系膜縱軸方向剪開腸腔，迅速用冰生理鹽水沖洗后，先行肉眼下潰瘍及炎癥評分，再取其中約2 cm長的組織予10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋以備免疫組化法檢測HMGB1、NF-kB陽性表達的強度。

1.4.2 潰瘍評分方法 參照朱峰等[5]的評分標準：0分 無損傷；1分 黏膜充血、水腫,但未出現(xiàn)潰瘍；2分 黏膜充血、水腫、輕度糜爛,無潰瘍；3分 黏膜充血、水腫、中度糜爛,有單個潰瘍；4分 黏膜充血、水腫、高度糜爛,有多處潰瘍；5分 黏膜充血、水腫、重度糜爛,有>1 cm潰瘍。

1.4.3 HMGB1、NF-kB檢測 嚴格按照HMGB1及NF-kB的抗體試劑盒操作流程在湖南中醫(yī)藥大學實驗樓5樓免疫組化室進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸潰瘍?nèi)庋塾^察及評分比較

空白組大鼠結(jié)腸黏膜基本正常，未見糜爛潰瘍、穿孔出血等；模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜充血嚴重，水腫明顯，表面欠光滑，呈糜爛狀，嚴重部位可見潰瘍甚至出血；曲池組黏膜表面不平整，充血、水腫較模型組稍輕，潰瘍數(shù)目及深度不及模型組明顯；上巨虛組結(jié)腸組織黏膜表面較平滑，無明顯充血，亦未見明顯出血糜爛，肉眼觀察較曲池組更接近空白組。如圖1所示。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織潰瘍?nèi)庋塾^察圖

潰瘍評分：與空白組相比,模型組與曲池組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比,曲池組有下降趨勢但無統(tǒng)計學意義（P>0.05），上巨虛組明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與曲池組相比，上巨虛組明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 結(jié)果見表 1。

2.2 各組大鼠結(jié)腸中NF-κB、HMGB1表達的比較

與空白組比較，模型組、曲池組及上巨虛組的NF-κB、HMGB1表達均有不同程度的增高，且模型組、曲池組差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），上巨虛組有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，曲池組與上巨虛組NF-κB、HMGB1的表達均有所下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；另外，上巨虛組NF-κB、HMGB1的表達明顯低于曲池組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠結(jié)腸潰瘍評分比較 （）

表1 各組大鼠結(jié)腸潰瘍評分比較 （）

注:與空白組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與曲池組比較，##P＜0.01。 下表同。

組別空白組模型組曲池組上巨虛組例數(shù)10 10 10 10潰瘍評分（分）0.20±0.42 2.10±0.88△△2.01±0.58△△0.60±0.70▲▲﹟﹟

表2 各組大鼠結(jié)腸中NF-κB、HMGB1平均光密度值的比較 （）

表2 各組大鼠結(jié)腸中NF-κB、HMGB1平均光密度值的比較 （）

組別空白組模型組曲池組上巨虛組例數(shù)10 10 10 10 NF-κB 0.22±0.04 0.37±0.05△△0.32±0.03△△▲▲0.26±0.03△▲▲﹟﹟HMGB1 0.25±0.03 0.39±0.02△△0.34±0.03△△▲▲0.29±0.03△△▲▲﹟﹟

3 討論

針刺穴位產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)作用早已在實驗與臨床中得到廣泛驗證[6]。HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，在感染及炎癥時其血漿水平顯著升高，起到重要的促炎效應(yīng)，參與多種自身免疫性疾病尤其是關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎等發(fā)病過程，可能是調(diào)控胃腸黏膜免疫損傷機制的重要信息分子[7]。NF-κB是一類在炎癥和免疫反應(yīng)過程中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與多種基因特別是免疫炎性反應(yīng)相關(guān)基因的表達調(diào)控，從而參與UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)[8-11]，因此，抑制NF-κB的表達與釋放，可以降低包括HMGB1在內(nèi)的炎性因子的水平，減輕UC腸道的炎性和免疫反應(yīng)，進而有效地保護腸黏膜。

本實驗中，與空白組比較，模型組肉眼潰瘍評分、結(jié)腸組織NF-κB、HMGB1表達均明顯增高，表明造模成功的同時也提示NF-κB、HMGB1參與了UC疾病的發(fā)展變化過程。相比模型組，電針曲池、上巨虛組均能降低UC的潰瘍評分及NF-κB、HMGB1在結(jié)腸中的表達，表明電針曲池、上巨虛組可通過降低NF-κB、HMGB1表達有效減輕腸道炎癥。進一步比較發(fā)現(xiàn)，上巨虛組相對于曲池組，潰瘍評分、NF-κB、HMGB1的表達均明顯降低，說明上巨虛組的抗炎作用要明顯優(yōu)于曲池組，從一定程度上證實了下合穴存在相對特異性。

綜上,本研究表明：(1)電針對UC的治療作用可能是通過調(diào)節(jié) NF-κB、HMGB1 等來實現(xiàn)的；(2)“上巨虛”存在相對特異性，據(jù)此認為“合治內(nèi)府”中的“合”主要應(yīng)指下合穴，其具體內(nèi)涵仍需進一步研究。

[1]Monique Adolphe,André-Laurent Parodi.Ethical issues in animal experimentation[J].Bulletin de L'Academie Nationale de Medicine,2009,193(8):1 803-1 804.

[2]李志晉，詹麗英,等.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化及腸組織中P-選擇素表達的研究.廣西醫(yī)科大學學報[J].2007,24(2):183-185.

[3]華興邦.大白鼠穴位圖譜的研究 [J].實驗動物與動物實驗，1991,1（1）：13-15.

[4]李忠仁.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003：425-431.

[5]朱 峰.細胞免疫反應(yīng)性炎癥性腸病動物模型的建立.中國醫(yī)學科學院學報[J].1998,20(4):271-277.

[6]黃 誠，韓立民.電針與免疫[J].山東醫(yī)藥.2012,16(4):91-92.

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[8]Lee JI Burckart G J Nuclear factor kappa Binportant transcription factor and therapeutic target[J].J C lin Pham acol 1998,38(11)：981-993.

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[10]Nosh-Escanilla M P,Pena A S.NF-kappa B and inllammatory intestinal diseases[J].Rev Esp Enferm Dig.1998， 90(2)：113-119.

[11]冀來喜，程艷婷，閏麗萍，等.電針“腸病方”腧穴對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織核因子—kbp65及血清白介素一4的影響[J].針刺研究.2013,1（2）：26-30.

（本文編輯 匡靜之）

The Effect of Quchi and Shangjuxu Acupoints on the Level of NF-κB,HMGB1 in Ulcerative Colitis Rats Models via Electro-acupuncture

YANG Lujia1,ZHANG Hong1*,ZHANG Yuchen2,DENG Shifeng1,WANG Zhenzhen1,SU Yanmei1
（1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Second Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan 410005,China）

ObjectiveTo observetheexpression levelof high mobility group box 1(HMGB1),nuclearfactorκB(NF-κB)in the ulcerative colitis(UC)rats and study related mechanism to further understand the meaning of"He-sea points"in"curing viscera diseases by He-sea points"after electro-acupuncturing"Quchi"and"Shangjuxu"acupoints.Methods The UC rats models were giventrinitrobenzene sulphoneacid(TNBS)/ethanol enema,then"Quchi"group and"Shangjuxu"group respectively

electro-acupuncture at"Quchi"and"Shangjuxu"acupoints for 10 consecutive days.24h after the last treatment,we dissected all rats and collected colon tissue to observe ulcer score and the expression level of HMGB1 and NF-κB.Results ① Compared with control group,th ulcer score，HMGB1 and NF-κB signifcantly increased(P＜0.01)in model group. ② Compared with model group,"Quchi"group and"Shangjuxu"group made obvious decrease in the ulcer score，HMGB1 and NF-κB(P＜0.01). ③ Compared with"Quchi"group,the ulcer score，HMGB1 and NF-κB decreased significantly(P＜0.01).Conclusion① Both of the large intestinal meridian's lower He-sea point"Shangjuxu"and upper He-sea point"Quchi"can improve the UC through decreasing the ulcer score,HMGB1 and NF-κB of the ulcerative colitis.②The treatment effect of"Shangjuxu"on the UC is better than"Quchi",it shows that"Shangjuxu"possess relative specificity.③Our results impartially suggest that"He points"in"curing viscera diseases by He points"mainly implicates the lower He point,and the specific mechanism still needs further research.

ulcerative colitis;electro-acupuncture;NF-κB;HMGB1;rat;Quchi point;Shangjuxu point

R574.62;R246.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05,017,058,04

2014－02－25

國家自然科學基金資助項目（81173327/H2718）;湖南省教育廳創(chuàng)新平臺項目 (11K047)。

楊璐佳，女，在讀碩士研究生，研究方向：針灸治病機制的研究。

*張泓，男，教授，博士研究生導師，E-mail:zh5381271@sina.com。