黃芩苷聯(lián)合黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

王 婷 ，黃立中 ，肖玉潔 ，羅 勇 ，吳雙華

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

黃芩苷聯(lián)合黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

王 婷1,2，黃立中1*，肖玉潔1，羅 勇2，吳雙華2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

目的 探討黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 將不同濃度的黃芩苷、黃芩素以及兩者聯(lián)合作用于人乳腺癌(Michigan Cancer Foundation 7，MCF-7)細(xì)胞。檢測(cè)上述化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的活力、凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 黃芩苷或黃芩素作用于乳腺癌細(xì)胞后，與作用前相比細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著升高(P<0.05)；兩者聯(lián)合應(yīng)用，與兩者單獨(dú)作用相比抗增殖作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩者作用后尤其是兩者聯(lián)用后細(xì)胞凋亡顯著增加。蛋白印跡分析顯示黃芩苷和黃芩素聯(lián)合作用后Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53的表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)下降，同時(shí)p-38活化亦增加。結(jié)論 黃芩苷和黃芩素均能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，兩者聯(lián)合應(yīng)用后作用明顯增強(qiáng)，其機(jī)制可能與其促進(jìn)促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53等的表達(dá)，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

黃芩苷；黃芩素；聯(lián)合治療；人乳腺癌；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一。占女性癌癥的四分之一，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)[1]。雖然近年來治療乳腺癌的方法和手段已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但病死率仍很高，侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其致死的最主要原因。尋找有效、低毒、價(jià)廉的治療藥物是目前研究的方向之一。眾所周知，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)需要細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間的平衡，包括細(xì)胞凋亡。腫瘤生長(zhǎng)是細(xì)胞增殖失控和凋亡不足所致，因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為治療癌癥的一種重要的有效的手段。

從植物中篩選有效抗腫瘤成分一直是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等藥物的臨床應(yīng)用激勵(lì)更多的學(xué)者投入植物藥尤其是傳統(tǒng)中藥有效成分抗腫瘤作用的研究。作為清熱解毒的傳統(tǒng)中藥黃芩的抗腫瘤作用近年受到關(guān)注。據(jù)報(bào)道[2-4]，黃芩的有效組分黃芩苷或黃芩素有潛在的抗肝臟、前列腺、膀胱腫瘤作用。目前雖有報(bào)道其有治療乳腺癌作用[5]，但對(duì)于其機(jī)制的研究還比較少，因此深入研究其作用機(jī)制將有助于了解中藥抗腫瘤的作用靶點(diǎn)及篩選出更有效的藥物。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

主要材料：黃芩素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度 99.8%，批號(hào)：071012)，黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度98.6%，批號(hào):110715-201016)，兩者均充分溶解于二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)中，配制成濃度為5 000μg/L的貯存液，避光，4℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度。DMSO的終濃度≤0.2%。兔抗人Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、Caspase-9(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9)、Bcl-2(B cell lymphoma 2，Bcl-2，B 細(xì)胞淋巴瘤基因-2)、Bax(Bcl-2 Associated X Protein，Bax,Bcl-2 相關(guān)x蛋白)、p53

和p-p38 MARK(磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶，p-p38)多克隆抗體均購(gòu)自上海研晶生化試劑有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)于北京中杉金橋。主要儀器：電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)(北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(GE公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(普朗醫(yī)療器械公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌(Michigan Cancer Foundation 7，MCF-7)細(xì)胞購(gòu)自湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。置于37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 MCF-7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(1.0×104個(gè)／孔)過夜，加入不同濃度的黃芩苷、黃芩素、黃芩苷和黃芩素（具體濃度見表1），培養(yǎng)72 h后，加入 20 μL 0.5%MTT液 37℃培養(yǎng)4 h后，離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，將培養(yǎng)板低速振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔的光密度值(OD)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-OD藥物組/OD空白對(duì)照組)×100%，DMSO溶劑為空白對(duì)照組。

1.2.3 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)(1)收集細(xì)胞蛋白：細(xì)胞培養(yǎng)同前，過夜后加入黃芩苷(22.3μg／mL)、黃芩素(6.8μg／mL)或兩者的聯(lián)合(黃芩苷22.3μg／mL+黃芩素 6.8μg／mL)，并設(shè)溶劑空白對(duì)照，藥物干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)裂解，收集蛋白質(zhì)液，BCA 法測(cè)蛋白濃度。(2)蛋白免疫印跡分析(Western blot)：灌制12%的分離膠和4%的濃縮膠；將蛋白樣品放入100℃的離子浴中5 min；按每泳道等量蛋白配置相應(yīng)的上樣體系；向各泳道中加入蛋白樣品及分子量Marker，以GAPDH作為內(nèi)參。電泳后剝膠，轉(zhuǎn)膜。1∶200 稀釋一抗(Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Baxp53、p-p38)并將稀釋液與轉(zhuǎn)印膜共同孵育，室溫2 h，取出轉(zhuǎn)印膜，漂洗后，1∶800稀釋二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，并將稀釋液與轉(zhuǎn)印膜共同孵育，室溫2 h；取出轉(zhuǎn)印膜，漂洗，底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色。將膠片拍照，應(yīng)用FluorChenm Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)(美國(guó)Alpha)分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶光密度值，目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白光密度值／GAPDH光密度值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin VFITC／PI雙染色法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板至70%～80%的融合，分別用黃芩苷(22.3μg/mL)、黃芩素(6.8μg/mL)及兩者聯(lián)合處理 12、24、48 h， 收集懸浮細(xì)胞 (1～5)×106／mL，PBS 洗 2 次， 加入 400 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育 15 min。 加 10 μL PI染色液(50μg/mL)，混勻，避光放置5 min。30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以Annexin V-FITC+PI-作為細(xì)胞早期凋亡標(biāo)志，計(jì)算各藥物濃度下MCF-7細(xì)胞的凋亡率，凋亡率：凋亡細(xì)胞數(shù)／(凋亡細(xì)胞數(shù)十正常細(xì)胞數(shù))×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用“”表示，多個(gè)均數(shù)間比較采用方差分析（析因設(shè)計(jì)資料方差分析和重復(fù)測(cè)量資料方差分析)，多組間每?jī)蓛杀容^采用SNK法，多組分別與一個(gè)對(duì)照組比較采用Dunnet-t法，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.1.1 不同濃度黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與空白對(duì)照組相比，單用黃芩苷或黃芩素作用MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著黃芩苷或黃芩素藥物作用濃度的增加，MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別與相應(yīng)的同濃度黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用相比顯著增加(P<0.05)。通過析因分析顯示兩者之間存在交互作用(P<0.05)。見表1。2.1.2 兩者聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 黃芩苷、黃芩素及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞24、48、72 h，分別測(cè)定細(xì)胞活力。黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用及聯(lián)臺(tái)應(yīng)用后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率明顯增加，尤以兩者聯(lián)合作用72 h對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制最為明顯。結(jié)果見表2。

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響 （，n=10，%）

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響 （，n=10，%）

注：不同濃度黃芩苷間比較*F=12.004，P=0.000；不同濃度黃芩素間比較*F=21.939，P=0.000；黃芩苷與黃芩素交互作用F=1.725，P=0.041。

黃苓素*（μg/mL）黃苓苷（μg/mL）#0 0 6.8 13.5 27.0 54.0 5.4±4.0 13.9±6.8 29.1±14.4 53.8±13.0 57.4±9.6 22.3 17.7±7.5 41.3±15.7 51.9±18.0 57.6±17.3 59.1±22.9 33.5 27.4±10.3 43.2±16.4 52.5±17.7 56.7±18.7 59.9±20.7 44.6 39.4±13.7 48.5±19.9 55.3±20.5 59.4±20.9 59.3±23.5 89.3 50.6±15.4 56.8±21.4 57.6±20.7 60.0±20.9 60.5±22.9

表2 MTT法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較 （n=10,,%）

表2 MTT法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較 （n=10,,%）

注：不同組別間比較*F=69.117，P=0.000；不同時(shí)間點(diǎn)間比較#F=25.055，P=0.000。

時(shí)間點(diǎn)#組別*空白對(duì)照黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合24 h 6.8±3.1 7.6±4.0 9.4±4.7 19.6±7.1 48 h 4.3±2.4 9.8±4.7 12.5±5.3 35.2±10.3 72 h 5.4±3.2 17.7±6.6 13.9±7.2 41.3±12.8

2.2 黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)影響的比較

與空白對(duì)照組比較，黃芩苷或黃芩素單用組Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53 等各蛋白表達(dá)水平均無顯著性差異，而在兩者聯(lián)合組觀察到Capase-3、Caspase-9、Bax和p53的蛋白表達(dá)明顯增高，同時(shí)有Bcl-2水平下降。在p-p38測(cè)定中可觀察到與空白對(duì)照組相比，黃芩苷或黃芩素單用組有表達(dá)增多的現(xiàn)象，而當(dāng)兩者聯(lián)合時(shí)p-p38的表達(dá)增加超過2倍以上，顯著高于黃芩苷、黃芩素單獨(dú)作用組（P<0.05）。 結(jié)果見表 3。

表3 黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞蛋白表達(dá)影響的比較 （n=10，）

表3 黃芩苷、黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞蛋白表達(dá)影響的比較 （n=10，）

注：與空白對(duì)照組比較*P﹤0.05，與兩者聯(lián)合組比較#P﹤0.05。

組別空白對(duì)照黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合Caspase-3 0.01±0.00 0.05±0.01 0.02±0.00 0.65±0.09*Caspase-9 0.02±0.00 0.03±0.00 0.05±0.01 0.68±0.08*Bcl-2 1.00±0.00 0.92±0.08 0.98±0.06 0.55±0.02*Bax 1.00±0.00 1.02±0.05 1.07±0.07 1.50±0.17*p53 1.00±0.00 0.98±0.11 0.97±0.10 1.35±0.14*p-p38 1.00±0.00 1.30±0.09#1.50±0.12#2.75±0.19*

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的比較

流式細(xì)胞術(shù)分析黃芩苷 (22.3μg/mL)、 黃芩素(6.8μg/mL)和黃芩苷(22.3μg/mL)+黃芩素(6.8μg/mL)聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞12、24、48 h后細(xì)胞凋亡情況。黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用48 h，分別只有2.75%和5.25%的MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，而兩者聯(lián)合48 h MCF-7細(xì)胞凋亡率為分別兩者單用的3.8倍和7.3倍。兩者聯(lián)合在24 h和48 h后MCF-7細(xì)胞凋亡率是12 h的94.38倍和154.9倍(結(jié)果見表4)。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的比較 （n=10,,%）

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的比較 （n=10,,%）

注：不同組別間比較*F=734.692，P=0.000；不同時(shí)間點(diǎn)間比較#F=718.185，P=0.000。

時(shí)間點(diǎn)#組別*黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合12 h 0.02±0.02 0.07±0.02 0.13±0.06 24 h 0.05±0.05 0.20±0.05 12.27±1.68 48 h 2.75±0.92 5.25±1.35 20.14±1.89

3 討論

細(xì)胞死亡通常表現(xiàn)為兩種形式：凋亡和壞死，凋亡代表“積極”的程序性細(xì)胞死亡，而壞死代表“消極”的細(xì)胞死亡。目前誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡已成為抗癌治療的一個(gè)關(guān)鍵策略。

研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用于MCF-7細(xì)胞均能產(chǎn)生明顯的抑制作用，且細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，這與以往的前列腺癌和膀胱癌[4]的研究結(jié)果基本一致。值得注意的是，與黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用相比，黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用更能顯著增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。本研究通過析因分析（見表1）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)黃芩苷22.3μg/mL和黃芩素6.8μg/mL最低有效濃度聯(lián)合應(yīng)用既能最大限度地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，相比于其他更高濃度的聯(lián)合組，其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本研究選擇黃芩苷（22.3μg/mL）和黃芩素（6.8μg/mL）的最低有效濃度聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，以探索兩者聯(lián)合應(yīng)用的作用機(jī)制。

既往研究顯示，黃芩提取物成分黃酮類化合物（包括黃芩苷和黃芩素）對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[3]。國(guó)內(nèi)徐維恒等[4]報(bào)道黃芩素能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們的研究中聯(lián)合了黃芩苷和黃芩素，以了解聯(lián)合應(yīng)用的效果。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MCF-7的細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用48 h與單用黃芩苷或黃芩素相比，凋亡率分別增加了約10倍或4倍。

通常細(xì)胞凋亡包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。其啟動(dòng)涉及多種外界因素及調(diào)節(jié)機(jī)制。雖然其詳細(xì)機(jī)制還未完全闡明，但各種凋亡途徑最終都匯聚于半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族。細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程。近年的研究表明，通過激活Caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5]。黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用48 h誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明，Caspase-9和Caspase-3可能是作為黃芩苷、黃芩素聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制而被激活。

線粒體途徑的Bcl-2蛋白的過度表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)凋亡途徑的抑制作用。促凋亡Bcl-2[6]家族成員(如Bax)與抗凋亡Bcl-2家族成員的比例增加，在線粒體外膜的孔隙形成，釋放凋亡線粒體蛋白，激活半胱天冬酶和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，與黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用相比，黃芩苷和黃芩素的聯(lián)合應(yīng)用后Bcl-2表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)增加。說明兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不僅涉及線粒體途徑，也通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2起作用。

p53基因是癌癥中最常見的突變基因，其功能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞凋亡中調(diào)控下游基因。已有報(bào)道，MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)p53依賴的凋亡[7]。本研究中，黃芩苷、黃芩素聯(lián)合應(yīng)用上調(diào)p53蛋白水平，表明p53參與了兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。

與黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用相比，黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用增加MCF-7細(xì)胞的凋亡，且誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53 有關(guān)。已有報(bào)道，黃芩苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡涉及MCF-7細(xì)胞中Bax和p53蛋白表達(dá)上調(diào)[8]。研究中我們用最低濃度的黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用，不引起明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，而兩者聯(lián)合應(yīng)用卻明顯增強(qiáng)。且無論是22.3μg／mL 黃芩苷或是 6.8μg／mL 黃芩素都不能單獨(dú)明顯改變某些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

p38 MAPK參與調(diào)控細(xì)胞對(duì)應(yīng)激和細(xì)胞因子的應(yīng)答。在許多腫瘤細(xì)胞中通過MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡而發(fā)揮抗癌的特性。有報(bào)道稱，黃芩素的作用涉及p38 MAPK。然而，MCF-7細(xì)胞中黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應(yīng)用是否也通過p38 MAPK機(jī)制的研究尚不清楚。研究結(jié)果提示，通過p38 MAPK信號(hào)通路黃芩苷和黃芩素的結(jié)合增加了細(xì)胞凋亡。在MCF-7細(xì)胞中黃芩苷和黃芩素的聯(lián)合誘導(dǎo)出黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用所未能誘導(dǎo)出現(xiàn)的某些凋亡蛋白。

當(dāng)兩種藥物產(chǎn)生類似療效時(shí)，與單個(gè)藥物療效簡(jiǎn)單之和相比，它們的聯(lián)合作用會(huì)產(chǎn)生更大的效果。藥物聯(lián)合的效果可能取決于藥物間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷或黃芩素單獨(dú)作用p53、Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2、Bax的水平均未發(fā)生明顯改變，提示在低濃度下兩種單體成分對(duì)這些凋亡相關(guān)蛋白的作用微弱。但當(dāng)黃芩苷和黃芩素聯(lián)合作用時(shí)，這些蛋白的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，提示兩者聯(lián)合的作用機(jī)制產(chǎn)生變化，這為研究抗癌藥物提供了新的可行有效的途徑。

總之，黃芩苷聯(lián)合黃芩素應(yīng)用通過p38 MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)了MCF-7細(xì)胞凋亡。激活Caspase-9和Caspase-3，下調(diào)Bcl-2和上調(diào)p53和Bax的表達(dá)，從而產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞的作用，為臨床治療提供了新的思路和依據(jù)。

[1]Tessari A，Palmieri D，Di Cosimo S.Overview of diagnostic/targeted treatment combinations in personalized medicine for breast cancer patients[J].Pharmgenomics Pers Med，2013，12(7):1-19.

[2]Kim SJ，Lee SM.Effect of baicalin on toll-like receptor 4-mediated ischemia/reperfusion inflammatory responses in alcoholic fattyliver condition[J].Toxicol Appl Pharmaco，2012，258(1)：43-50.

[3]Parajuli P，Joshee N，Rimando AM，et a1.In vitro antitumot mechanisms of various scutellaria extracts and constituent flavonoids[J].Planta Med， 2009，75(3):41-48.

[4]徐維恒，肖 雷，馬宜明.黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和MDAMB-231 增殖的影響[J].中國(guó)藥師，2011，14(1):26-28.

[5]Yu SS，Spicer DV，Hawes D，et al.Biological effects of green tea capsule supplementation in presurgery postmenopausal breast cancer patients[J].Front Oncol，2013，13(3):291-299.

[6]Martin LA，Dowsett M.BCL-2：a new therapeutic target in estrogen receptor-positive breast cancer[J].Cancer Cell，2013，24(1):7-9.

[7]Tokgun O，Akca H，Mammadov R，et al.Convolvulus galaticus，Crocus antalyensis，and Lilium candidum extracts show their antitumor activity through induction of p53mediated apoptosis on human breast cancer cell line MCF-7 cells[J].J Med Food，2012，15(11):1 000-1 005.

[8]Kong W，Jiang X，Mercer WE.Downregulation of Wip-1 phosphatase expression in MCF-7 breast cancer cells enhances doxorubicin induced apoptosis through p53 mediated transcriptional activation of Bax[J].Cancer Biol Ther，2009，8(6):555-563.

（本文編輯 楊 瑛）

Effect and Mechanism of Baicalin and Baicalein Induced Cell Apoptosis in Breast Cancer Cells

WANG Ting1，2， HUANG Lizhong1*,XIA0 Yujie1， LUO Yong2， WU Shuanghua2
(1.College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China； 2.Central Hospital of Zhuzhou,Zhuzhou,Hunan 412007， China)

Objective To study the breast cancer cell apoptosis is induced by the combination therapy of baicalin and baicalein and its related mechanism.Methods Different concentrations of baicalin，baicalein and combined effects of the two drugs in breast cancer MCF-7 cells,testing drugs on breast cancer cell viability， apoptosis and apoptosis-related protein expression.Results Baicalin or baicalein acting on the breast cancer cells，cell growth inhibition was significantly higher(P＜0.05)；compared with baicalin or baicalein alone,the combination treatment with baicalin and baicalein significantly enhanced the anti-proliferative effect(P＜0.05).Cell apoptosis was significantly increased after treating with baicialin or baicalein especially the combination of baicalin and baicalein.Western blot analysis revealed that the expression of Caspase-3,Caspase-9,Bax and p53were increased.Meanwhile,the level of Bcl-2 expression was decreased.Moreover， the activation of p-38 were increased.Conclusions Baicalin and baicalein could induce the apoptosis of breast cancer cells alonely， while the effects significantly enhanced after the combination with baicalin and baicalein.This mechanism may be related with the drugs activate the expression of apoptosis-related protein Caspases-3,Caspase-9,Bax and p53， down-regulate the level of Bcl-2， and inhibit the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.

baicalin； baicalein； combination therapy； breast cancer； cells apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.006.023.05

2013－10－08

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(20114323110006)；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金(湘財(cái)教指[2009]70號(hào)-09k058)。

王 婷，女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)。

*黃立中，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:hlz992002@163.com。