Hedgehog信號(hào)通路分子Shh、Ptch和Smo在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)

李韻秋 匡志鵬 吳繼寧 孔 娜 楊 帆

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(primary human hepatocellular，HCC)是現(xiàn)今常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率在我國(guó)有明顯增加趨勢(shì)，比歐美國(guó)家高5～10倍，是全球發(fā)生率最高的國(guó)家［1，2］。有研究顯示，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是肝癌細(xì)胞無(wú)限增殖與凋亡減少的結(jié)果，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中扮演著重要角色，隨著對(duì)肝癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)部的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制與肝癌的發(fā)生、發(fā)展等有著緊密的聯(lián)系。近幾年來(lái)，Hedgehog信號(hào)通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展變化中的作用進(jìn)行了初步的探索，大多數(shù)報(bào)道結(jié)果為肝癌發(fā)生與Hedgehog信號(hào)通路關(guān)系密切，并且是最近探討肝癌機(jī)制研究的熱點(diǎn)，但是具體作用尚不清楚［3］。本研究通過(guò)觀察HH信號(hào)通路成員Shh、Ptch和Smo在化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討Hedgehog信號(hào)通路與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

1．主要試劑與藥品:免疫組織化學(xué)用Shh、Ptch和Smo兔抗鼠多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)。SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)?？俁NA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)。M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物有限公司合成。Real-Master Mix(SYBR Green)(Takara公司)。定量PCR儀為美國(guó)MJR公司產(chǎn)品。組織蛋白裂解液及發(fā)光底物試劑盒(上海碧云天Beyotime公司)，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)用Shh和Ptch兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司)，Smo兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，GAPDH單克隆抗體和羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司)。

2．C57BL/6J小鼠肝癌模型制備:小鼠造模階段已在前期實(shí)驗(yàn)中獲得成功，簡(jiǎn)要過(guò)程如下:選取符合標(biāo)準(zhǔn)的95只正常C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組45只及誘癌組50只，對(duì)照組僅喂以小鼠顆粒飼料及滅菌普通水，誘癌組采用化學(xué)法［二乙基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)/乙醇］誘發(fā)小鼠肝癌，于誘癌開(kāi)始后第4周隨機(jī)處死誘癌組及對(duì)照組小鼠各5只，此后以相同方法處理第6、8、10、12、14、16、18 和 20 周的兩組小鼠，獲取各周期誘癌組和對(duì)照組肝組織標(biāo)本，蘇木精-伊紅(HE)染色鏡檢提示成功誘發(fā)小鼠肝癌，具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。

3．免疫組織化學(xué)檢測(cè)Shh、Ptch和Smo的表達(dá):SP法簡(jiǎn)略步驟:組織標(biāo)本石蠟包埋-切片-脫蠟-抗原修復(fù)-滴加一抗4℃過(guò)夜-按照試劑說(shuō)明書(shū)二抗孵育-DAB顯色-蘇木素復(fù)染-脫水封片。每例切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級(jí)［5］，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:(1)陽(yáng)性細(xì)胞百分率:未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞者為0分，＜25%為1分，25% ～75%為2分，＞75%為3分。(2)顯色深淺:不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將以上2項(xiàng)相加最終評(píng)定結(jié)果，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為中度陽(yáng)性(++)，＞5分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，且陽(yáng)性結(jié)果定義為細(xì)胞質(zhì)伴或不伴有細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Shh、Ptch蛋白顆粒，細(xì)胞核伴或不伴有細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Smo蛋白顆粒。

4．RT-PCR法檢測(cè)Shh、Ptch和Smo mRNA的表達(dá):按照試劑盒對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄。Shh基因上游引物:5'-AAAGCTGACCCCTTTAGCCTA-3';下游引物:5'-TTCGCAGTTTCTTGTGATCTTCC-3'。Ptch基因上游引物:5'-AAAGAACTGCGGCAAGTTTTTG-3';下游引物:5'-CTTCTCCTATCTGACGGGT-3'。Smo基因上游引物:5'-ATGATGGACCTGTTGCG-3';下游引物:5'-GTTGGCTTGTTCTTCTGG-3'。β-actin基因上游引物:5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3';下游引物:5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'。按25μl反應(yīng)體系進(jìn)行。反應(yīng)條件為:95℃30s，95℃ 5s，62．2℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)。得到目的基因及相應(yīng)內(nèi)參的CT值。

5．Western blot法檢測(cè) Shh、Ptch和 Smo蛋白的表達(dá):內(nèi)參選用GAPDH，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要步驟:提取組織總蛋白測(cè)定其濃度-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-滴加一抗4℃培育過(guò)夜-加入羊抗兔IgG-HRP二抗-洗膜，然后按化學(xué)發(fā)光法試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行發(fā)光、壓片。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 16．0。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組小鼠肝組織中未檢測(cè)到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(dá)(圖1A、圖2A和圖3A)。在誘癌組中，3種蛋白在小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為第6周時(shí)檢測(cè)Shh蛋白的表達(dá)為弱陽(yáng)性(圖1B)，第16周時(shí)出現(xiàn)中度陽(yáng)性(圖1C)，到第20周時(shí)Shh蛋白在小鼠肝癌組織中的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性(圖1D)。誘癌組小鼠肝癌組織中Ptch蛋白在第8周時(shí)的表達(dá)結(jié)果為弱陽(yáng)性(圖2B)，第16周時(shí)在小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為中度陽(yáng)性(圖2C)，到第20周時(shí)表達(dá)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性(圖2D)。且小鼠肝癌組織中Smo蛋白分別在第10周、第16周和第20周時(shí)出現(xiàn)弱陽(yáng)性、中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖3B～D)。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Shh在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)

2．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果:通過(guò)已知相對(duì)定量方法分析數(shù)據(jù):①改變的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT;②ΔΔCT=(CT 靶基因 -CT 內(nèi)參)誘癌組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組。如表1所示，誘癌組小鼠肝組織和其對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組小鼠肝組織的表達(dá)顯示:誘癌組與對(duì)照組兩者的小鼠肝組織中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達(dá)在第4周時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。從第6周開(kāi)始(包括第6周)，誘癌組中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，P＜0．001)。而Smo誘癌組與Smo對(duì)照組兩者的小鼠肝組織中Smo mRNA的表達(dá)在第4周和第6周時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。從第8周開(kāi)始(包括第8周)，Smo誘癌組中Smo mRNA的表達(dá)才明顯高于Smo對(duì)照組中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，P ＜0．001)。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ptch在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Smo在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)

表1 不同誘癌周期小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA分別在其誘癌組的表達(dá)與其相對(duì)應(yīng)對(duì)照組的表達(dá)比較(2-ΔΔCT)

同一對(duì)照組中各周期之間的表達(dá)顯示:對(duì)照組中小鼠肝組織中的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA 的表達(dá)在第4、6、8、10、12、14、16、18、20 周變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。而同一誘癌組中后一周期與前一周期之間的表達(dá)顯示:Shh誘癌組中，9個(gè)階段中，后一周期Shh mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，P ＜0．001)。Ptch誘癌組中，Ptch mRNA 在第 6周的表達(dá)與第4周的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，第8周時(shí)的Ptch mRNA表達(dá)明顯高于第6周(P＜0．05)，第10周時(shí)的表達(dá)同樣明顯高于第8周(P＜0．05)，第12周的表達(dá)與第10周的表達(dá)差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。此后，后一周期Ptch mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，P ＜0．001)。Smo誘癌組中，Smo mRNA在第6周的表達(dá)與在第4周的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，第8周時(shí)的Smo mRNA表達(dá)與第6周時(shí)的表達(dá)、第10周時(shí)與第8周時(shí)的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，到第12周時(shí)，Smo mRNA的表達(dá)與第10周時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。此后，第14周表達(dá)明顯高于第12周(P＜0．05)，第16周明顯高于第14周(P＜0．05)，第 18周明顯高于第 16周(P＜0．05)，第20周時(shí)達(dá)最高，與第18周時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

從整個(gè)誘癌過(guò)程可以看出，隨著小鼠誘癌周期的增長(zhǎng)，誘癌組的3種mRNA的表達(dá)量分別均呈逐步上升趨勢(shì)，至第20周時(shí)3組誘癌組中三者表達(dá)水平均達(dá)到各自的最高值，分別是Shh mRNA為15．986±1．784，Ptch mRNA 為 11．272 ± 0．295，Smo mRNA為10．185 ±0．716。

4．蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果:如圖4所示。以誘癌組中GAPDH(37kDa)(圖4中D1)的表達(dá)條帶為準(zhǔn)，設(shè)定為強(qiáng)表達(dá)。3種蛋白在誘癌組小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為誘癌組第4周時(shí)，未檢測(cè)出Shh蛋白的表達(dá)，第6周開(kāi)始出現(xiàn)Shh蛋白的表達(dá)，此時(shí)表達(dá)較弱，從第8周至第20周表達(dá)增強(qiáng)，第16周、第18周和第20周時(shí)表達(dá)的條帶均有增寬(圖4中A1，Shh 45kDa)。誘癌組中Ptch蛋白在第4周和第6周均未檢測(cè)出，到第8周時(shí)出現(xiàn)較弱的表達(dá)，第10周到第14周表達(dá)量有所增加，至第16～20周時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)(圖4中B1，Ptch 160kDa)。而誘癌組Smo蛋白到第10周時(shí)方檢測(cè)出蛋白的表達(dá)，隨著誘癌時(shí)間的遞增，Smo蛋白的表達(dá)量逐漸增多，第20周表達(dá)最顯著，條帶明顯增寬(圖4中C1，Smo 86kDa)。以對(duì)照組中GAPDH(37kDa)(圖4中D2)的表達(dá)條帶為準(zhǔn)，設(shè)定為強(qiáng)表達(dá)。對(duì)照組小鼠肝組織中未檢測(cè)到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(dá)(圖4中A2、B2、C2)。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Shh、Ptch和Smo蛋白在誘癌組及對(duì)照組小鼠肝癌組織中的表達(dá)情況

討 論

Hedgehog(HH)信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胚胎的發(fā)育成熟、器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、組織損傷后的修復(fù)和再生、某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的分化與浸潤(rùn)中起重要作用，是維持腫瘤干細(xì)胞的重要信號(hào)通路［6］。最近越來(lái)越多的研究顯示，當(dāng)該通路被異常激活時(shí)能導(dǎo)致多種腫瘤形成，如基底細(xì)胞癌、胃癌和胰腺癌等［7～9］。HH信號(hào)通路的失調(diào)同樣也參與肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，從肝臟的胚胎發(fā)生上來(lái)看，肝臟來(lái)源于前腸末端的肝憩室，HH信號(hào)通路在胚胎肝細(xì)胞增殖和分化調(diào)控中起重要作用，但是隨著肝臟的逐漸形成，HH信號(hào)通路相關(guān)蛋白也逐漸消失，在正常成人肝臟中，Hedgehog信號(hào)通路處于靜止?fàn)顟B(tài)，不表達(dá)或很少表達(dá)。但不少研究者發(fā)現(xiàn)，該通路成分在肝癌中出現(xiàn)了異常高表達(dá)，在肝癌組織中可見(jiàn)Hedgehog信號(hào)通路的異常激活［10］。其中，Shh配體，跨膜蛋白受體Ptch和Smo是Hedgehog信號(hào)通路的核心成員。研究表明，Shh基因是編碼一系列分泌蛋白的基因家族，它編碼一系列分泌型信號(hào)蛋白，1980年首先在果蠅基因分析中被發(fā)現(xiàn)，其編碼的Shh蛋白是整條信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，是Hedgehog信號(hào)通路的重要組成部分［11］。Smo基因?yàn)樵┗?，編碼的Smo蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體，有7個(gè)跨膜區(qū)，在HH信號(hào)通路中發(fā)揮著橋梁作用。有研究認(rèn)為Ptch可能發(fā)揮抑癌作用，是一個(gè)抑癌基因，能特異性抑制Smo的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，避免HH信號(hào)通路過(guò)度活化引發(fā)腫瘤。在沒(méi)有Shh配體信號(hào)刺激下，Ptch與Smo結(jié)合，抑制Smo的活性，該信號(hào)通路處于失活狀態(tài)。過(guò)多的Shh蛋白表達(dá)使Shh蛋白與Ptch蛋白結(jié)合，解除了Ptch蛋白對(duì)Smo的抑制，Smo被激活，繼而激活轉(zhuǎn)錄因子Gli，進(jìn)而啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，從而調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過(guò)建立C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型，并采用免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Shh、Ptch和Smo三者的基因及蛋白在該模型中的定性和定量表達(dá)情況，更好地了解Hedgehog信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法在對(duì)照組全程均未檢測(cè)到Shh、Ptch和Smo的顯著性變化，主要原因是正常肝細(xì)胞中三者僅出現(xiàn)微量變化，實(shí)驗(yàn)方法的敏感度使檢測(cè)受到限制。誘癌組前期Shh、Ptch和Smo三者的變化也均不明顯:免疫組織化學(xué)法顯示，誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別在第6周、第8周和第10周才出現(xiàn)弱陽(yáng)性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，誘癌組小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)分別至第6周、第6周和第8周開(kāi)始，才明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，P ＜0．001)。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別從第6周、第8周和第10周起出現(xiàn)弱表達(dá)。這說(shuō)明在誘癌前期小鼠肝組織僅為炎癥反應(yīng)性病變，三者的表達(dá)有所上升，但是上升的幅度并不大，由于免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果為定性分析，未能表述出蛋白在量上的變化趨勢(shì)，因此表達(dá)差異并未檢測(cè)出。只有實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)敏感度高，得到Shh、Ptch和Smo在此期間的變化差異。從第10周開(kāi)始至第14周，各誘癌組與同一組別同一周期對(duì)照組的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，P＜0．001)。且三者的表達(dá)量在此過(guò)程中是逐漸增加的趨勢(shì)，Shh誘癌組中，后一周期Shh mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平(P＜0．05)，Ptch mRNA和Smo mRNA兩者在第14周期的表達(dá)也明顯高于在第12周期的表達(dá)(P＜0．05)。在第16周時(shí)，小鼠肝組織重度非典型增生。同時(shí)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Shh、Ptch和Smo蛋白表達(dá)均呈中度陽(yáng)性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)大幅度上升。蛋白質(zhì)印跡法顯示三者的目的條帶較前均有所增寬。此后隨著誘癌周期的遞增，Shh、Ptch和Smo的表達(dá)在定量和定性方法檢測(cè)中均呈上升趨勢(shì)，到20時(shí)達(dá)最盛。此時(shí)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Shh、Ptch和Smo表達(dá)均呈強(qiáng)陽(yáng)性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法(計(jì)算結(jié)果 Shh mRNA 為15．986±1．784，Ptch mRNA 為 11．272 ± 0．295，Smo mRNA 為 10．185 ±0．716)和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三者表達(dá)均達(dá)最大化，此時(shí)癌組織已經(jīng)形成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型建立的過(guò)程是一個(gè)由量變轉(zhuǎn)化到質(zhì)變的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，簡(jiǎn)陋的解釋了Hedgehog信號(hào)通路中Shh、Smo和Ptch在分子水平的變化規(guī)律。三者的增長(zhǎng)趨勢(shì)基本上是同步的，對(duì)照組中3種分子的水平變化均不明顯。在誘癌組中，誘癌初期，即第8周前Shh基因表達(dá)增加，編碼過(guò)多的Shh配體，使得其與稍弱增強(qiáng)表達(dá)的Ptch受體結(jié)合，Smo的抑制作用被解除，整條Hedgehog信號(hào)通路被激活，隨著化學(xué)誘癌劑的繼續(xù)作用，三者表達(dá)量顯著增加，彼此相互作用，發(fā)揮著正性調(diào)控的作用，致使誘癌達(dá)到20周時(shí)成功誘發(fā)小鼠肝癌，表達(dá)最盛。

綜上所述，正常對(duì)照組小鼠肝組織中Shh、Ptch和Smo表達(dá)量低而未被檢測(cè)出，而在化學(xué)誘癌組中Hedgehog信號(hào)通路在誘癌的早期就已經(jīng)被激活，其成員Shh、Ptch和Smo表達(dá)量的持續(xù)增加所形成的微環(huán)境的不斷變化調(diào)控著小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程，但確切的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究，以及與肝癌中其他信號(hào)通路之間的共同調(diào)控作用機(jī)制也需要做進(jìn)一步的探索。本研究模擬人體肝癌模型，對(duì)Shh、Ptch和Smo在小鼠肝癌的始動(dòng)發(fā)生到形成肝癌的過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的闡述，為將來(lái)開(kāi)展基因工程藥物的研究和肝癌的靶向治療打下良好的基礎(chǔ)。

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