麻杏石甘湯對哮喘大鼠氣道上皮STAT6和黏蛋白表達(dá)的調(diào)控

虞 琳 朱麗君 張怡靜 葉樂平

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘，asthma)是一種伴有細(xì)胞因子產(chǎn)生異常及氣道內(nèi)變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)生的免疫失衡性疾病，即Th1/Th2失衡［1］。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與哮喘的發(fā)病機(jī)制，其中白介素13(IL-13)激活的 Janus激酶(janus kinases，JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)通路是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一，在促進(jìn)哮喘炎癥、黏液高分泌中發(fā)揮重要作用，也是目前的研究熱點(diǎn)［2］。麻杏石甘湯(maxingshigan decoction，MGD)出自我國國粹《傷寒論》，因其有辛涼宣肺、止咳平喘之功，在歷史上應(yīng)用已久?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其不僅有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱的功效，還能抗炎、抗過敏、抗病原微生物以及改善血液循環(huán)。但其在哮喘治療中的具體機(jī)制仍未明確，為其臨床應(yīng)用帶來一定的局限性。因此，本研究擬通過建立哮喘大鼠模型，研究IL-13、STAT6、黏蛋白表達(dá)，來探討麻杏石甘湯抑制氣道炎癥、減少黏液分泌的可能機(jī)制。

材料與方法

1．藥物及試劑:卵清白蛋白(ovalbumini，OVA)、焦磷酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購自美國 Sigma公司，大鼠IL-12、IL-13 ELISA試劑盒來自美國R＆D公司，STAT6兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司(Lot#GR52323-3)，二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液均購自北京中衫金橋，AB-PAS染色試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司，其余試劑為市售分析純試劑。

2．MGD 的制備:麻黃6g、杏仁6g、甘草5g、石膏 20g(購自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)，MGD的煎制參照中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》。煮石膏20min，將雙蒸水浸泡0．5h后的麻黃、杏仁、甘草放入同煎15min，取第1道汁后再加入雙倍雙蒸水，煎15min，取汁，混合第1、2道汁，濃縮至相應(yīng)體積。高、中、低劑量中藥組分別含生藥24．6、12．3和6．15g/kg。于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理:SPF級幼年雄性SD大鼠55只(購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重120～180g，隨機(jī)分為5組:對照組(A組)、哮喘組(B組)、哮喘+高劑量MGD組(C組)、哮喘+中劑量MGD組(D組)、哮喘+低劑量MGD組(E組)，每組11只。哮喘模型的制作分致敏和激發(fā)兩階段。致敏階段:B組分別于第1天和第8天注射卵含白蛋白(OVA)和氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液，A組用等量的生理鹽水替代。激發(fā)階段:第2次致敏1周后，將B～E組哮喘大鼠放入自制的密閉有機(jī)玻璃箱(40cm×30cm×20cm)中，含1%OVA的生理鹽水霧化吸入，每天1次，每次30min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)3天;A組用生理鹽水代替OVA進(jìn)行。C～E組在第2次致敏后第4天開始分別予高、中、低劑量MGD灌胃，每天2次，激發(fā)階段則每次激發(fā)前后4h灌胃同等劑量MGD。

4．標(biāo)本的制備:末次激發(fā)24h后腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg，后行腹主動(dòng)脈切開取血處死。即刻切開氣管，切取左肺脫水、石蠟包埋，切片后行HE染色、免疫組化、AB-PAS染色。經(jīng)氣管插管行右肺灌洗，留取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，2000r/min離心15min，取上清-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5．BALF中IL-12和 IL-13濃度測定:應(yīng)用 sandwich ELISA法檢測BALF中IL-12、IL-13的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過程參照試劑說明書進(jìn)行。

6．免疫組化法:石蠟切片脫蠟至水，高壓修復(fù)3min，室溫冷卻后PBS沖洗，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，先后予蒸餾水、PBS沖洗后，5%山羊血清封閉非特異性抗體，37℃水浴箱孵化30min，滴加 STAT6兔抗鼠多克隆抗體(1∶100)，4℃過夜;復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵化30min;PBS沖洗后行DAB染色，鏡下觀察顯色反應(yīng)，蒸餾水中終止反應(yīng)后予蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)后脫水、透明，中性樹膠封片。陽性結(jié)果呈棕黃色，用圖像分析儀IPP6．0測定肺組織平均吸光度值(IOD)作為STAT6蛋白免疫組化檢測及定量測定相對含量。

7．AB-PAS法檢測氣道黏蛋白表達(dá):石蠟切片脫蠟至水，3%醋酸水溶液室溫1min，1%Alcian blue染色液染色15min，蒸餾水洗后1%過碘酸氧化8min，Schiff染色12min，水洗后脫水封片。硫酸化黏液呈黑色，酸性黏液呈藍(lán)色，中性黏液呈紅色。檢測方法同免疫組化。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 17．0，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本均數(shù)比較采用方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．哮喘模型的生物學(xué)判斷:哮喘組大鼠OVA霧化激發(fā)時(shí)多表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、四肢顫動(dòng)、毛色失去光澤，嚴(yán)重者四肢癱軟，俯伏不動(dòng)，呼吸節(jié)律不規(guī)則。不同劑量MGD組大鼠激發(fā)后表現(xiàn)均較哮喘組明顯減輕。

2．大鼠 BALF中 IL-12、IL-13(圖1):哮喘組BALF中IL-13濃度顯著高于A組，不同劑量MGD組中該值均較B組低且呈劑量相關(guān)性，其中C、D組與B組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。與A組相比，IL-12在B組含量明顯下降，而采用MGD干預(yù)后BALF中IL-12含量呈濃度依賴性升高。

3．大鼠肺組織病理改變(圖2):A組大鼠氣道、血管形態(tài)規(guī)整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。B組氣道、血管肌層明顯增生，周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，基膜增厚，部分氣道上皮脫落，管腔內(nèi)可見黏液栓。C～E組肺組織炎性細(xì)胞浸潤、血管平滑肌增生均較B組減輕，且隨著劑量的增加，改善越顯著。

4．MGD對STAT6表達(dá)的影響(圖3、表1):B組肺組織STAT6蛋白在各級氣管、支氣管上皮呈棕黃色強(qiáng)陽性表達(dá)，血管和肺間質(zhì)未見明顯表達(dá)，而A組肺組織中STAT6蛋白呈陰性或極小部分弱陽性表達(dá)，其含量顯著低于B組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。MGD明顯下調(diào)哮喘大鼠肺組織氣道上皮的STAT6含量，但高于A組，且C、D組STAT6表達(dá)較B組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖1 MGD對哮喘大鼠BALF中IL-12、IL-13的影響

圖2 氣道炎癥病理學(xué)變化(HE染色，×400)

圖3 大鼠氣道上皮STAT6表達(dá)(免疫組化，×400)

5．MGD對黏蛋白表達(dá)的影響(圖4、表1):運(yùn)用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，B組氣道上皮黏蛋白表達(dá)較A組明顯增多(P＜0．01)，尤以大氣道為著。MGD能明顯減少氣道黏蛋白的表達(dá)，與B組相比，各組大鼠氣道上皮黏蛋白含量均顯著降低(P＜0．05)。

圖4 哮喘大鼠氣道上皮黏蛋白表達(dá)(AB-PAS法，×400)

表1 各組大鼠氣道上皮STAT6、黏蛋白的吸光度(IOD)檢測(±s)

表1 各組大鼠氣道上皮STAT6、黏蛋白的吸光度(IOD)檢測(±s)

與 A 組比較，*P ＜0．05，與 B 組比較，△P ＜0．05

組別 STAT6黏蛋白A組0．176 8 ±0．0406 0．169 2 ±0．0230 B 組 0．248 6 ±0．0409* 0．230 9 ±0．0335*C 組 0．205 5 ±0．0316△ 0．181 6 ±0．1796△D 組 0．219 6±0．0220＊△ 0．184 8±0．0262＊△E 組 0．229 6 ±0．0355* 0．204 3 ±0．0277＊△

討 論

隨著哮喘發(fā)生率的逐年攀升，對其機(jī)制的研究也日漸深入。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與哮喘的發(fā)病，分別介導(dǎo)著細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和黏附因子在哮喘發(fā)病中的作用。其中IL-13激活的JAK/STAT通路是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一，也是目前的研究熱點(diǎn)，因此本研究選擇該通路作為切入點(diǎn)［2］。而氣道黏液高分泌不僅導(dǎo)致氣流受限，還增加氣道反應(yīng)性，過度的黏液分泌提示哮喘控制不佳，是許多哮喘患兒的共同臨床特點(diǎn)，與發(fā)病率和病死率的升高相關(guān)。

STAT家族成員參與許多細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是整個(gè)JAK/STAT信號通路的核心分子，近年來發(fā)現(xiàn)在全身多系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)7個(gè)STAT亞型，其中STAT6與哮喘關(guān)系最為密切。目前認(rèn)為“Th2優(yōu)勢應(yīng)答”是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而筆者前期研究［3］表明，STAT6是誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th2細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵性作用。IL-13被認(rèn)為是與哮喘發(fā)病最為直接相關(guān)的Th2因子之一，它參與哮喘的氣道炎癥和重塑，包括黏液分泌，IgE合成，EOS招募，氣道成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞增殖［4］。有研究認(rèn)為IL-13/STAT6信號通路通過增強(qiáng)氣道高反應(yīng)、促進(jìn)炎癥發(fā)生而在哮喘發(fā)病中起著關(guān)鍵作用［5］。本研究中哮喘組氣道上皮STAT6表達(dá)較對照組明顯升高，其肺組織周圍炎性細(xì)胞浸潤顯著，BALF中IL-13濃度高于對照組，提示哮喘大鼠在變應(yīng)原激發(fā)下STAT6高表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)其下游炎癥因子IL-13等Th2因子大量生成，使Th1/Th2失衡，從而在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。

氣道黏液是人體呼吸道的第1道防御屏障，是一種由脂質(zhì)、糖結(jié)合物和蛋白質(zhì)組成的溶液，起到屏障、濕潤、運(yùn)輸、免疫的作用［6，7］。氣道黏液中含有 2%的黏蛋白(mucin)，由特異性的MUC所編碼。在目前已知的20種人類MUC中，只有MUC5AC和MUC5B編碼正常人氣道分泌物中的黏蛋白［8］。MUC5B是人和小鼠小氣道基底層的主要凝膠形成黏蛋白，以發(fā)揮清除功能為主，從而維持氣道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，MUC5AC則是氣道炎癥時(shí)被上調(diào)的主要黏蛋白。在各種原因所導(dǎo)致的氣道炎癥如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等中，黏蛋白分泌明顯增高，且持續(xù)的黏液高分泌可導(dǎo)致氣道阻塞、氣流受損、肺功能進(jìn)行性下降、細(xì)菌感染機(jī)會增加等。與COPD相比，哮喘患者的氣道黏液更為黏稠，易產(chǎn)生凝膠狀的黏液栓并可能阻塞氣道［9］。Kondo等［8］發(fā)現(xiàn)使用 IL-13 處理后杯狀細(xì)胞含量增加10倍，提示IL-13能夠刺激杯狀細(xì)胞化生、黏蛋白形成。Tyner等［10］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用IL-13干預(yù)氣-液交界面的小鼠氣道上皮細(xì)胞時(shí)，能誘導(dǎo)纖毛細(xì)胞向杯狀細(xì)胞化生。另有研究發(fā)現(xiàn)肺組織STAT6是黏膜分泌的關(guān)鍵性調(diào)控因子，氣道黏膜分泌功能與STAT6的表達(dá)與激活有關(guān)。江德鵬等［11］用IL-13刺激HBE16細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MUC5AC和p-JNK1/2表達(dá)升高，使用SP600125阻斷JNK通路后，MUC5AC表達(dá)減弱，認(rèn)為IL-13通過JNK-STAT6-FOXA2通路調(diào)控黏液分泌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘組氣道上皮黏蛋白(主要是大氣道)、STAT6表達(dá)均較對照組明顯增多，提示STAT6可能通過誘導(dǎo)大量IL-13產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)氣道杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌，引起一系列病理生理改變，從而參與哮喘氣道黏液高分泌的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)僅能說明哮喘時(shí)IL-13、STAT6、黏蛋白均升高，其具體信號通路的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

近年來中西醫(yī)聯(lián)合治療兒童哮喘受到越來越多學(xué)者的重視。支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮證”范疇，為冷哮、熱哮。MGD出自漢代醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、炙甘草、石膏4味藥組成，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，是治療熱哮的良方。麻黃和石膏共為君藥，杏仁降利肺氣而平喘，為臣藥;炙甘草益氣和中，為使藥。作為國粹的經(jīng)典偏方，其在臨床中的應(yīng)用由來已久?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)MGD中麻黃所含的麻黃堿為 β2受體激動(dòng)劑，可活化腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，舒張支氣管平滑肌痙攣;杏仁所含的苦杏仁苷經(jīng)酶水解后產(chǎn)生氫氰酸，可使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于安靜而奏止咳平喘作用，并能促進(jìn)動(dòng)脈壁前列腺I2(PGI2)樣物質(zhì)生成，擴(kuò)張微血管，改善微循環(huán);生石膏的成分主要為含水硫酸鈣對支氣管神經(jīng)肌肉有抑制及鎮(zhèn)靜作用，加上鈣質(zhì)能降低支氣管通透性，故有解除支氣管痙攣的作用［12］。但其對哮喘氣道黏液高分泌的影響及其通過哪種信號通路其作用國內(nèi)外尚無報(bào)道。

本研究結(jié)果證明MGD能減少哮喘大鼠EOS浸潤，減輕變態(tài)反應(yīng)。而運(yùn)用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，MGD組大鼠氣道上皮黏蛋白分泌明顯少于哮喘組，且呈濃度依賴性，提示MGD能減輕哮喘的黏液高分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠在不同濃度MGD灌胃后，氣道上皮STAT6、BALF中IL-13含量均呈劑量相關(guān)性下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lee等［2］相符。因此筆者推測哮喘黏液高分泌與IL-13/STAT6通路密切相關(guān)，MGD可能通過減少炎癥介質(zhì)IL-13、下調(diào)STAT6的表達(dá)，進(jìn)而減少EOS的浸潤，減輕氣道炎癥反應(yīng)，降低了哮喘的氣道黏液高分泌。但也有研究認(rèn)為，哮喘大鼠黏液高分泌是通過獨(dú)立的ERK/PKC通路起作用［13］。因此其具體信號通路及相關(guān)炎癥因子，MGD的具體制劑、濃度等還有待更進(jìn)一步的研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MGD能減少哮喘大鼠IL-13、STAT6、黏蛋白的表達(dá)，可能通過 IL-13/STAT6/黏蛋白通路減輕炎癥反應(yīng)，減少黏液分泌，為其現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。相信隨著哮喘機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，臨床MGD片劑、STAT6抑制劑等的研發(fā)，將為哮喘的中西醫(yī)結(jié)合治療開辟新的途徑。

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