環(huán)化小檗堿類似物A55的抗腫瘤活性及其機(jī)制研究

趙午莉 李陽彪 何紅偉 宋丹青 邵榮光

小檗堿(berberine)又叫黃連素，為中藥黃連中的主要生物堿。有多種藥理作用，臨床主要用于清熱、解毒、抗腸道細(xì)菌抗感染以及糖尿病的治療［1～3］。近年研究發(fā)現(xiàn)小檗堿(BBR)還具有抗腫瘤活性，體內(nèi)外的抗腫瘤活性檢測表明其能夠特異性地抑制白血病、黑素瘤、表皮樣癌、肝癌、口腔癌、惡性膠質(zhì)瘤等癌細(xì)胞的增殖而不影響正常細(xì)胞的生長［4～8］。本研究所在長期進(jìn)行小檗堿類衍生物的研究中，基于對相關(guān)有機(jī)反應(yīng)的深刻理解，合成并構(gòu)建了一類未見報(bào)道的全新化合物結(jié)構(gòu)——環(huán)化小檗堿(CBBR)，即在BBR分子中又駢合了一個芳香環(huán)。結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)CBBR不但與另一類具有顯著抗癌作用的生物堿——苯駢菲里啶類化合物結(jié)構(gòu)相似，而且本身還具備BBR的分子結(jié)構(gòu)，因此我們推測CBBR有可能為一類具有較強(qiáng)抗腫瘤作用的化合物，初步研究結(jié)果表明其對HCT116細(xì)胞的IC50為1．0μmol/L左右?；诖?，筆者以CBBR為先導(dǎo)化合物較為系統(tǒng)地合成了30個化合物并對其抑瘤率進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBBR的8-位經(jīng)基進(jìn)行芳香?；?，引入鄰氟苯甲酰基合成的化合物A55具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，因此我們著重對A55的抗腫瘤活性以及其相應(yīng)機(jī)制做了進(jìn)一步的研究［9］。

材料與方法

1．細(xì)胞系及化合物:人肝癌細(xì)胞系 HepG2、SMMC7721、BEL7402、BEL7404、人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及人大腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29由本實(shí)驗(yàn)室保存;環(huán)化小檗堿及合成的相應(yīng)衍生物A10～A50由筆者單位合成，結(jié)構(gòu)及其合成路線見參考文獻(xiàn)［9］。

2．主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO);新生胎牛血清(Hyclone公司);SRB(sulforhodamine B，Sigma公司);PI(propidium iodide，Sigma公司);預(yù)染蛋白Marker(New England Biolabs公司);DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Topgen);質(zhì)粒pBR322DNA(Takara);兔抗人抗體p-ATM、r-H2AX和Cleaved Parp等抗體購自Cell Signal Technology公司。

3．化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率及IC50的測定:在96孔板上孔接種不同的腫瘤細(xì)胞，24h后采用不同濃度的化合物進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖48h后，用50%三氯乙酸 (TCA)固定，并用SRB(0．4%)稀醋酸溶液染色。室溫靜置10min，未與細(xì)胞結(jié)合的SRB用1% 稀醋酸溶液5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用10mmol/L非緩沖Tris堿液(pH值10．5)振蕩溶解，酶標(biāo)儀測定各孔光吸收，測定波長為492nm。根據(jù)各孔OD值計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率。計(jì)算公式為抑制率(%)=(1-化合物OD492/對照OD492)×100%。采用Sigmaplot計(jì)算化合物的IC50。

4．流式細(xì)胞儀測定方法:用0．2μg/ml的化合物A55處理HepG2細(xì)胞，分別在0、4、8、12和24h收集藥物處理后的細(xì)胞，PBS洗兩次，加入預(yù)冷的75%乙醇，-20℃固定過夜，離心除去乙醇，PBS洗兩次，加入200μg/ml的RNA酶，37℃消化30min，加碘化丙啶(PI)25μg/ml，4℃避光染色30min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化［10］。

5．拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制實(shí)驗(yàn):將1U撲異構(gòu)酶Ⅰ和不同濃度的藥物在37℃反應(yīng)20min，再加入0．5μg的pBR322DNA在37℃繼續(xù)反應(yīng) 30min，加入 0．5% 的 SDS，0．25μg/μl的溴酷蘭，15%的甘油終止反應(yīng)。在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖電泳，40V電壓下，電泳4h。溴化乙淀溶液染色30min，置于紫外線下觀察DNA的電泳區(qū)帶，并攝片記錄。

6．Western blot:將 A55加入到 HepG2細(xì)胞中，使A55的終濃度達(dá)到1μg/ml，24h后取實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后加熱變性。每組取40μg蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗 (1∶1000)4℃ 孵育過夜，采用TBST洗膜5次，加入HRP標(biāo)記二抗(1∶5000)，室溫下孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1．化合物 A55的抗腫瘤活性篩選:首先采用HCT116細(xì)胞對先導(dǎo)化合物CBBR及其30個衍生物(A10～A50)的抗腫瘤活性進(jìn)行篩選，篩選濃度為3μg/ml。結(jié)果表明有15個化合物的抑制率達(dá)到了85%以上。接著采用0．5μg/ml的濃度對這15個化合物繼續(xù)篩選。結(jié)果表明，化合物A55的抑制率最高，達(dá)到了90%左右，化合物A32和A45的抑制率分別為62%和68%，高于其他化合物。對化合物A55、A32和A45的IC50進(jìn)行檢測，結(jié)果表明其IC50分別為0．18 ±0．01、0．46 ±0．03 和 0．4 ±0．05μg/ml，A55 的活性最高。此后筆者選用A55(圖1)對具其抗腫瘤活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并初步探討了其抗腫瘤機(jī)制。

2．A55對多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用:筆者采用 BEL7402、BEL7404 SMC7721、HT29、A549 以及MCF-7等腫瘤細(xì)胞對環(huán)化小檗堿CBBR及其衍生物A55的IC50進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明A55對多種類型的腫瘤均具有良好的抑制作用，抑制效果明顯強(qiáng)于先導(dǎo)化合物CBBR，結(jié)果見表1和圖2。

圖2 A55對不同腫瘤細(xì)胞系的IC50

3．A55對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ具有較強(qiáng)的抑制作用:TopⅠ在體外可使DNA雙鏈中的單鏈斷裂，使另一單鏈從缺口處穿過，催化超螺旋的DNA松弛解旋。本實(shí)驗(yàn)中A55對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的解螺旋活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A55在和pBR322DNA以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ共同孵育時(shí)，可完全逆轉(zhuǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ對底物pBR322DNA的解螺旋作用，而其直接和底物pBR322DNA作用時(shí)，pBR322DNA并無明顯的改變，因此我們認(rèn)為A55可有效地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性(圖3)。

4．A55可將細(xì)胞周期阻滯于S期:為了進(jìn)一步探化合物 A55的抗腫瘤機(jī)制，筆者檢測了 A55對HepG2細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果表明，化合物A55作用于HepG2細(xì)胞4h后，細(xì)胞的周期開始阻滯于S期，并隨著時(shí)間的增加，S期阻滯不斷加強(qiáng)，到24h，阻滯達(dá)到最強(qiáng)(圖4)。

圖3 A55對TopⅠ的抑制作用

圖4 A55對HepG2細(xì)胞周期分布的影響

5．A55通過促進(jìn) DNA鏈斷裂引起凋亡:由于A55抑制了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性，阻止了DNA斷端的再連接，引起了DNA斷裂和細(xì)胞凋亡。因此我們檢測了A55處理細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡以及與凋亡和DNA斷裂相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，A55可明顯引起HepG2細(xì)胞凋亡(圖5A)，如細(xì)胞核濃縮、碎裂及溶解等現(xiàn)象。Western blot結(jié)果表明，在A55作用于HepG2細(xì)胞24h后，與DNA斷裂相關(guān)的蛋白p-ATM和 γ-H2AX明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白cleaved parp和cleaved caspase-3明顯增加(圖5B)。

圖5 A55引起細(xì)胞凋亡并激活DNA修復(fù)通路

討 論

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ是一種核酶，可松解DNA超螺旋，在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等重要過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中TopⅠ的含量和活性要明顯高于正常細(xì)胞，如果能選擇性抑制TopⅠ的生理作用，便能有效抑制腫瘤細(xì)胞的DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而引起細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖［11］。因此，TopⅠ成為抗腫瘤藥物作用的重要靶點(diǎn)。目前在臨床使用和處于研發(fā)階段的TopⅠ抑制劑主要包括喜樹堿類(camptochecines)和吲哚并咔唑類(indolocarbazoles)等化合物但由于水溶性差、不良反應(yīng)強(qiáng)以及耐藥使得這些藥物的應(yīng)用受到了限制，因此開發(fā)結(jié)構(gòu)新且藥效強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物非常重要［12］。Li等［13］報(bào)道小檗堿能與TopⅠ結(jié)合，使S期細(xì)胞合成受阻，阻止細(xì)胞增殖。CBBR是一類全新結(jié)構(gòu)骨架的化合物——環(huán)化小檗堿，由于其具有更好的平面性結(jié)構(gòu)特征，更加容易嵌入雙鏈DNA堿基對里，推測可能具有更好的抗腫瘤作用。采用HepG2細(xì)胞對CBBR 的 IC50檢測，IC50在 1．2μmol/L 左右，活性顯著強(qiáng)于BBR［9］。A55是在CBBR結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造而形成的一類衍生物，即在CBBR的8-位經(jīng)基進(jìn)行芳香?；豚彿郊柞；?。改造后的 A55對HCT116的抗腫瘤活性顯著強(qiáng)于 CBBR，IC50達(dá)到了0．18μg/ml，對其他腫瘤的結(jié)果也表明其 IC50在1μg/ml左右，顯示了良好的抗腫瘤活性。

在DNA復(fù)制過程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ在DNA雙鏈上產(chǎn)生單鏈斷裂，使另一單鏈從缺口處穿過，使得DNA從超螺旋變?yōu)槭杷尚?，進(jìn)而一些與DNA復(fù)制相關(guān)的酶結(jié)合到DNA上，啟動了染色體的復(fù)制。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑與拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合后抑制了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化活性，使得斷裂的DNA不能重新進(jìn)行連接，進(jìn)而導(dǎo)致 DNA鏈發(fā)生致命性的破壞，造成DNA損傷，從而激活DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)及相應(yīng)的DNA損傷應(yīng)答修復(fù)通路(DNA damage response，DDR)進(jìn)行修復(fù)［14，15］。這些通路包括細(xì)胞內(nèi)的感應(yīng)器如 ATM的快速識別損傷，啟動下游多種效應(yīng)成分如H2AX及引起周期阻滯的蛋白通路，提供時(shí)間進(jìn)行損傷修復(fù)。其中最為顯著和具有標(biāo)志意義的是H2AX的磷酸化，如損傷不能正確修復(fù)或不能修復(fù)，凋亡和非凋亡性死亡(apoptosisand non-apoptoticdeath)程序?qū)⒈粏樱?6］。環(huán)化小檗堿衍生物A55在和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ以及底物DNA共同作用時(shí)可顯著抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的解螺旋作用，但其單獨(dú)和超螺旋DNA反應(yīng)并不影響pBR322DNA的構(gòu)型改變，表明A55是通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來影響pBR322DNA的構(gòu)型。由于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性受到抑制，使得DNA鏈在解旋后不能再連接而引起DNA斷裂，因此我們觀察到與DNA斷裂相關(guān)的蛋白如ATM和H2AX被磷酸化激活。

細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，需要拓?fù)洚悩?gòu)酶來解螺旋并在DNA復(fù)制結(jié)束后再改變雙鏈DNA拓?fù)湓傩纬沙菪虼送負(fù)涿冈诩?xì)胞的S期的活性和表達(dá)量最高，因此，當(dāng)拓?fù)涿甘艿揭种茣r(shí)，細(xì)胞的DNA復(fù)制過程會嚴(yán)重受阻并使得細(xì)胞可能停滯在S期。本實(shí)驗(yàn)中，化合物A55通過主要通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性而引起的DNA損傷的修復(fù)，周期分布實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了細(xì)胞停滯在S期，這也同樣與通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性而致DNA損傷的羥基喜樹堿衍生物引起的S期阻滯是一樣的［17］?；衔顰55具體是通過激活或抑制了哪些通路而導(dǎo)致了S期阻滯，今后我們也將進(jìn)一步進(jìn)行研究。腫瘤細(xì)胞在A55的持續(xù)作用下，由于修復(fù)不能完全進(jìn)而活化了促使細(xì)胞凋亡的一系列酶如csapase-3，活化后的 csapase-3裂解了parp從而最終引起細(xì)胞凋亡。

總之，環(huán)化小檗堿衍生物A55是一類鏢靶明確、結(jié)構(gòu)新穎以及抗腫瘤活性強(qiáng)的新型抗腫瘤化合物，且本所可以自主合成開發(fā)。隨著對其作用機(jī)制研究的逐漸深入，這一類從生物堿中發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤新藥的前景將會更加廣闊。

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