NK 細胞免疫突觸形成過程研究進展

朵 榮 朵瑞雪

(甘肅省蘭州大學第二附屬醫(yī)院風濕科，甘肅省蘭州市永登縣人民醫(yī)院內科，蘭州 730200)

NK 細胞又叫大顆粒淋巴細胞，通過產生淋巴因子和細胞毒活性，在抗感染和抗腫瘤發(fā)生、免疫調節(jié)、造血調控及自身免疫性疾病等方面起到重要的作用。它通過細胞毒活性直接清除病原體。

免疫突觸，最初認為是T 細胞和APC 之間形成的一個超分子結構，主要參與TCR 與MHC/多肽復合物結合，是T 細胞活化所必須的結構微域。T 細胞免疫突觸形成的主要標志性的結構是超分子活化簇(SMACs)的形成，且分成周邊(pSMAC)和中央區(qū)(cSMAC)［1］，所以突觸處大規(guī)模的分子聚集和分子的劃分被重新看到在免疫相關疾病中的研究價值。

NK 細胞免疫突觸(NKIS)和T 細胞的IS 相似，可激活免疫，在多種免疫相關性疾病中發(fā)揮重要的作用，但NKIS 也不同于T 細胞免疫突觸。如NK 細胞用多種胚系編碼激活受體作為IS 信號;T 細胞不產生抑制性突觸，也不定位一些基本蛋白;NK 細胞有能力形成多種不同的IS 等［2］。但最主要的不同為NK 細胞含有天生的識別和殺傷非正常或患病細胞的能力，可以通過和靶細胞形成緊密連接，即形成溶酶免疫突觸的形式，殺傷靶細胞。這代表了在此過程中通過一系列的步驟釋放特殊的細胞器-溶酶顆粒的動態(tài)的分子排列［3］。

成熟和功能性的NK 細胞溶酶突觸的形成可以分為多個階段:識別階段、觸發(fā)階段、效應階段、終末階段。每個階段又可分為若干小階段［4］。這些過程使得溶酶顆粒傳遞到突觸上，且進一步加強突觸和靶細胞的緊密連接，從而將溶酶顆粒釋放到靶細胞。NK 細胞免疫突觸的形成對免疫相關性疾病的發(fā)生發(fā)展起到至關重要的作用，但是國內此方面研究性論文及綜述甚少，因此，本文在以下篇幅將詳述成熟的NK 細胞溶酶突觸形成的各個階段。

1 識別和觸發(fā)階段

1.1 靶細胞與NK 細胞相遇及初步結合 NK 細胞和靶細胞黏著的第一步是通過趨化信號作用下的小范圍的相互作用，使得NK 細胞駐扎在靶細胞上。雖然還未具體明確哪些分子參與NK 細胞突觸的形成，但是可能有選擇素家族的成員，在某些體內試驗可證明這一點［5］。再者，近幾年有研究證明IL-15的受體IL-15Rα 中的高親成分，聚集在NK 細胞突觸的中心。同時，IL-15Rα 缺陷的NK 細胞(從感染性單核細胞增多癥患者得到)在與DC 細胞共培養(yǎng)時突觸形成明顯減少［6］。此外，NKG2D 是NKG2 家族的成員，主要表達在NK 細胞和γδT 細胞的表面，是一個表達在T 細胞亞群和NK 細胞表面的活化性受體。研究證明受體NKG2D 及其配體共同聚集在NK 細胞的免疫突觸上的富集GM1(神經節(jié)苷脂)的微區(qū)域［5］，且最新研究通過高分辨全內反射顯微鏡觀察到NKG2D 與LFA-1 同樣主要分布在溶酶顆粒分泌的周邊環(huán)［7］。另外，有研究證明CD2 在NK 突觸有很明顯的聚集［8］，這些都可能是促進NK 細胞免疫突觸形成及活化的主要分子。

1.2 受體-配體之間的作用導致的靶細胞與NK 細胞相應部位的緊密粘著從而激起初始活化信號 在溶酶突觸形成中的另外一步是靶細胞與NK 細胞之間的緊密黏著，黏附分子及受體-配體之間的作用是其主要形成因素。(1)整合素家族的黏附分子起到很大作用，特別是LFA1/CD11a/CD18 和MACI，這些整合素在NK 細胞被觸發(fā)的瞬間形成簇狀結構或可能在黏附之前就發(fā)揮作用，從而參與免疫突觸的形成和信號轉導［9，10］。IFA-1，它誘導信號分子的磷酸化，如Src、Vav-1、LAT、SLP76、ZAP70、JNK、ERK1/2、PKC 的磷酸化，且導致小顆粒分化成為NKIS［8，11，12］。重要的是，LFA-1 也通過早期活化信號誘導肌動蛋白的磷酸化，從而導致了F 肌動蛋白在外周分子活化簇的聚集。另外，有研究表明PKCθ在免疫突觸的大量聚集可顯著增強NK 細胞的活性和功能［13］。(2)表面散在分布的NK 細胞激活受體，如天然細胞毒受體家族，在生理情況下，這些受體的子集可能通過配體連接到靶細胞上，促進了NK 細胞的活化。

2 效應階段

2.1 溶酶突觸的形成 這個階段主要是由肌動蛋白的重建來實現(xiàn)的。它主要依賴單體G 肌動蛋白池的網絡結構中F 肌動蛋白的形成，且F 肌動蛋白的形成依賴WASP(促進F 肌動蛋白的蛋白單元)的存在［14］，有研究表明在缺少WASP 或在肌動蛋白抑制劑存在的情況下，聚集在突觸部位的F 肌動蛋白減少，同時，NK 細胞的細胞殺傷毒性也減少［15，16］。

目前，肌動蛋白的重建過程尚未完全清楚，但已明確的影響肌動蛋白重建的主要有以下幾方面。

2.1.1 受體的成簇聚集 許多受體由于它們在細胞膜上的彌散分布，從而表達在初始階段的突觸中，其中某些受體，在與靶細胞結合后迅速聚集成簇，從而促進肌動蛋白的重建。在NK 細胞，肌動蛋白依賴的受體簇形成的潛在機制尚未明確，但有研究表明ERM 蛋白家族表達在NK 細胞溶酶突觸上，并且對其他細胞的受體活性起到一定的影響作用［16］。

2.1.2 脂筏結構的聚集 簡單地說，脂筏就是膜脂雙分子層結構內所含有的一種液態(tài)有序相微區(qū)。脂筏具有兩個顯著特點:(1)許多蛋白質聚集在脂筏內，便于相互作用;(2)脂筏的環(huán)境有利于蛋白質的變構，形成有效的構象。所以說“脂筏”(lipid rafts)是免疫突觸形成的平臺。

脂筏聚集成簇被認為介導了細胞信號通路的激活，是將許多細胞通路的成分聚集在一起的結構基礎。此外，與受體簇相同，脂筏加強免疫突觸的形成也是依賴肌動蛋白的聚合。有研究表明CD94/NKG2A 能阻止肌動蛋白依賴的活性脂筏受體的聚集，從而起到阻止突觸形成的作用［17］。

2.1.3 活化信號的生成 活化受體和脂筏等結構的參與招募了重要分子的信號傳導，如Src、Lck、Fyn、Syk、ZAP70、SLP76、Vav-1、PLCγ、PKCθ、BLNK、LAT、2k2、SHP-1，同時也影響了肌動蛋白的重建，因此，近期研究表明T 細胞活化的抑制信號ITAM 在NK 細胞相關免疫突觸中，通過破壞免疫突觸的相關結構而產生免疫耐受［18］。此外，活化受體引起的信號小體在cSMAC 導致信號級聯(lián)，使得信號放大和產生生物效應，如細胞毒作用和細胞因子的分泌等［10，19］。

2.1.4 MOTC 及溶酶顆粒的極化重分布 在這個過程中，隨著細胞溶解通路PI3K-ERK2 和PLCγ -JNK 的活化［12，20］，微管組織中心(MOTC)向突觸運動，錨定在突觸上，且逐漸分化成為活性免疫突觸的一部分。與此同時，溶酶顆粒順著微管移動到微管組織中心(MTOC)，且在MTOC 周圍聚集，這就為NK 細胞釋放溶酶顆粒內容物打下了基礎。研究表明CIP4 敲除以后，嚴重地損害了MTOC 的分化和細胞毒作用［21］。

2.2 溶酶顆粒從細胞內分泌出來后被招募到突觸膜表面 在共軛發(fā)生后的45 min，NK 細胞和靶細胞的接觸面部分出現(xiàn)缺口，造成了一個55 nm 深的可口袋［22］致使溶酶顆粒分泌出來，細胞表面上散在的溶酶顆粒通過F-肌動蛋白的多條管道被招募到突觸上，之后，傳送溶酶顆粒到細胞膜的管道被清除，有研究通過高分辨技術發(fā)現(xiàn)溶酶顆粒在NK 細胞突觸處具有很高的活動性，且需要F-actin 在脫顆粒后維持相關的活動性［23］。傳統(tǒng)的3D 共焦技術觀察到在溶酶顆粒分泌出形成一個厚的皮質肌動蛋白的中空的環(huán)，而最新研究使用現(xiàn)代超分辨顯微鏡觀察后對突觸形成處有了全新的認識，觀察到F-actin在突觸處形成廣泛網絡，確保溶酶顆粒的分泌［7］。

2.3 溶酶顆粒膜和質膜的融合，溶酶顆粒內容物的釋放 當溶酶顆粒被MOTC 傳送到了近突觸處后，并通過微管終末動力將其送到了NK 細胞質膜，這樣就促進了溶酶顆粒與質膜的結合。一旦溶酶顆粒穿過F-肌動蛋白和質膜相連接，可能在NK 細胞溶酶突觸的效應階段中會形成多個終末階段。

3 終末階段

溶酶突觸的終末階段是溶酶顆粒內容物釋放結束后的過程。通過一個階段的活性下降和活性受體的聚集減弱，使NK 細胞從靶細胞上分離下來且導致細胞溶解能力的再循環(huán)。

NKG2D 是表達在NK 細胞表面的活化性受體，其與配體的結合常導致細胞應激的結果，如DNA 的損壞，病毒和腫瘤的感染等［24］。在NK 細胞免疫突觸的終末階段，NKG2D 表達下降［22］。此外，一些受體，如2B4 和NKp467 也有報道表達下降［25，26］。

Fas 配體(FasL)是NK 細胞的主要細胞毒性致死因素，它在細胞內作為一種跨膜蛋白主要分泌溶酶體?；罨螅@些小囊泡遷移到了細胞毒性免疫突觸，F(xiàn)asL 暴露在細胞表面通過死亡受體CD95 和靶細胞上的配體結合激活細胞的死亡［27］。

4 結語

本文所提及的是NK 細胞通過和靶細胞形成溶酶突觸后殺傷靶細胞的過程。在此過程中，仍有很多值得今后去進一步研究的，如細胞如何通過溶解靶細胞從而殺傷靶細胞，此外，溶酶突觸和MOTC進一步關系的研究等等，這些研究勢必為風濕病內在機制的探索提供重要條件。

［1］Barcia C，Thomas CE，Curtin JF，et al.In vivo mature immunological synapses forming SMACs mediate clearance of virally infected astrocytes from the brain［J］.J Exp Med，2006，203 (9):2095-2107.

［2］Konrad K，Jack LS.The killer's kiss:the many functions of NK cell immunological synapses［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20(5):597-605.

［3］Keri BS，Jordan SO.Navigating Barriers:The Challenge of Directed Secretion at the Natural Killer Cell Lytic Immunological Synapse［J］.J Clin Immunol，2010，30(3):358-363.

［4］Chen S，Kawashima H，Lowe JB，et al.Suppression of tumor formation in lymph nodes by L-selectin-mediated natural killer cell recruitment［J］.J Exp Med，2005，202(12):1679-1689.

［5］Johanna E，F(xiàn)iona EM.Inhibitory receptor signals suppress ligationinduced recruitment of NKG2D to GM1-Rich membrane domains at the human NK cell immune synapse［J］.J Immunol，2007，178(9):5606-5611.

［6］Fabienne Brilot，Till Strowig.NK cell survival mediated through the regulatory synapse with human DCs requires IL-15Rα［J］.J Clin Invest，2007，117(11):3316-3329 .

［7］Mace EM，Orange JS.New views of the human NK cell immunological synapse:recent advances enabled by super-and high-resolution imaging techniques［J］.Front Immunol，2013，3:421.

［8］Riteau B，Barber DF，Long EO.Vav1 phosphorylation is induced by beta2 integrin engagement on natural killer cells upstream of actin cytoskeleton and lipid raft reorganization［J］.J Exp Med，2003，198(3):469-474.

［9］Davis DM.The human natural killer cell immune synapse［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(26):15062-15067.

［10］Vyas YM.Spatial organization of signal transduction molecules in the NK cell immune synapses during MHC class I-regulated noncytolytic and cytolytic interactions［J］.J Immunol，2001，167(8):4358-4367.

［11］Perez OD，Mitchell D，Jager GC，et al.LFA-1 signaling through p44/42 is coupled to perforin degranulation in CD56+CD8+natural killer cells［J］.Blood，2004，104(4):1083-1093.

［12］Chen X，Allan DSJ，Krzewski K，et al.CD28-stimulated ERK2 phosphorylation is required for polarization of the microtubule organizing center and granules in YTS NK cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(27):10346-10351.

［13］Merino E，Abeyweera TP，F(xiàn)irth MA，et al.Protein kinase C-θ clustering at immunological synapses amplifies effector responses in NK cells［J］.J Immunol，2012，189(10):4859-4869.

［14］Orange JS.Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for NK cell cytotoxicity and colocalizes with actin to NK cell-activating immunologic synapses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(17):11351-11356.

［15］Orange JS，Harris KE，Andzelm MM，et al.The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(24):14151-14156.

［16］Gismondi A.Cutting edge:functional role for proline-rich tyrosine kinase 2 in NK cell-mediated natural cytotoxicity［J］.J Immunol，2000，164(5):2272-2276.

［17］Masilamani M，Nguyen C，Kabat J，et al.CD94/NKG2A inhibits NK cell activation by disrupting the actin network at the immunological synapse［J］.J Immunol，2006，177(18):3590-3596.

［18］Huse M，Catherine Milanoski S，Abeyweera TP，et al.Building tolerance by dismantling synapses:inhibitory receptor signaling in natural killer cells［J］.Immunol Rev，2013，251(1):143-153.

［19］Vyas YM，Maniar H，Dupont B.Visualization of signaling pathways and cortical cytoskeleton in cytolytic and noncytolytic natural killer cell immune synapses［J］.Immunol Rev，2002，189:161-178.

［20］Li C，Ge B，Nicotra M，et al.JNK MAP kinase activation is required for MTOC and granule polarization in NKG2D-mediated NK cell cytotoxicity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(8):3017-3022.

［21］Pinaki P，Banerjee，Rahul Pandey.Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological synapse［J］.JEM，2007，204 (10):2305-2320.

［22］McCann FE.The size of the synaptic cleft and distinct distributions of filamentous actin，ezrin，CD43，and CD45 at activating and inhibitory human NK cell immune synapses［J］.J Immunol，2003，170(6):2862-2870.

［23］Mace EM，Wu WW，Ho T，et al.NK cell lytic granules are highly motile at the immunological synapse and require F-actin for postdegranulation persistence［J］.J Immunol，2012，189 (10):4870-4880.

［24］Gasser S，Orsulic S，Brown EJ，et al.The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor［J］.Nature，2005，43(7054):1186-1190.

［25］Sivori S.2B4 functions as a co-receptor in human NK cell activation［J］.Eur J Immunol，2000，30(3):787-793.

［26］Sandusky MM，Messmer B，Watzl C.Regulation of 2B4(CD244)-mediated NK cell activation by ligand-induced receptor modulation［J］.Eur J Immunol，2006，36(12):3268-3276.

［27］Marcus Lettau，Jing Qian.The adaptor protein Nck interacts with Fas ligand:Guiding the death factor to the cytotoxic immunological synapse［J］.PNAS，2006，103(15):5911-5916.