小鼠MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的重建及Hsf1，SV40T-ag 蛋白的表達①

蔣杞英 張 智 胡延忠 王明麗 馬遠方 (鄭州大學基礎醫(yī)學院，鄭州 450052)

熱休克轉錄因子1(Heat shock transcription factor 1，Hsf1)是熱休克反應的主要調控者。Hsf1 介導的熱休克反應不僅保護細胞免受環(huán)境或細胞內應激引起的損傷，而且涉及到對許多病理過程的調節(jié)，如炎癥和腫瘤的形成［1-4］。眾多研究表明，在調節(jié)腫瘤形成和發(fā)展的過程中，Hsf1 起了非常重要的作用，Hsf1 和其相關的下游靶蛋白(如HSPs)在大多數(shù)癌組織中是增高的［5-7］。

猴腎病毒40(Simian Virus 40，SV40)是雙鏈的DNA 腫瘤病毒，已經從HIV 陽性的非何杰金氏淋巴瘤病人組織中分離出來［8］。SV40 能夠表達兩種早期的癌蛋白小t 抗原(t-antigen，t-ag)和大T 抗原(Tantigen，T-ag)，T-ag 通常被用作轉基因腫瘤鼠模型和用于轉化細胞的體外研究［9］。致瘤作用主要是通過病毒性產物SV40 大T 抗原(T-antigen，T-ag)來完成的，能夠使很多種細胞發(fā)生惡性轉化［10，11］。

逆轉錄病毒介導的基因轉移是80 年代才發(fā)展起來的一種高效基因轉移技術。逆轉錄病毒載體能將目的基因高效整合于靶細胞染色體，具有高效、穩(wěn)定表達的特點，并且安全性很高，是最早成功應用于臨床基因治療的載體［12，13］。

為了更好地研究Hsf1 基因的功能，本文將重建帶有鼠全長Hsf1 基因的逆轉錄病毒載體pWZLBlast-Flag-Hsf1 和Hsf1 過表達的MEF/Hsf1-/-/Hsf1細胞系。MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的建立，為進一步研究Hsf1 的功能提供細胞實驗模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鼠抗兔HSF1 抗體(Sc-9144)(美國Santa Cruz 公司);鼠抗兔SV40T-ag 抗體(Sc-20800)(美國Santa C ruz 公司);鼠抗小鼠β-actin抗體(A0605)(美國Sigma 公司);羊抗兔IgG(ZB-2301)和羊抗小鼠IgG(ZB-2305)(北京中杉金橋公司)。

1.1.2 細胞系和質粒 由湖南大學湘雅基礎醫(yī)學院肖獻忠教授饋贈。(1)細胞系:①WT/MEF 細胞:應用SV40T-抗原永生化從C57B16/V129 基因背景小鼠分離的野生型胚胎成纖維細胞。②MEF/Hsf1-/-細胞:應用SV40T-抗原永生化從C57B16/V129 基因背景小鼠分離的Hsf1 敲除的胚胎成纖維細胞。③包裝病毒細胞293Phoenix:為小鼠的包裝細胞，在逆轉錄病毒載體轉染時用。(2)質粒:pWZL-blast 質粒和pWZL-blast-hsf1-flag1.9 質粒。pWZL-blast-hsf1-flag1.9 質粒將全長Hsf1 的cDNA 與N末端的Flag-tag 連接，亞克隆到逆轉錄病毒載體pWZL-blast，構建pWZL-blast-flag-hsf1 重組體。

1.1.3 半定量RT-PCR 引物設計 根據(jù)GenBank報道的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計并合成引物以擴增SV40T-ag、p53 和Hsf1(β-actin作為內參)，引物序列遞交上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將細胞放入含有100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。取生長狀態(tài)好、處于對數(shù)生長期的細胞進行以下實驗。

1.2.2 半定量RT-PCR 實驗 主要是檢測Hsf1和SV40T-ag 基因在WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中mRNA 的表達水平。

1.2.2.1 細胞總RNA 的提取 (1)收集5 ×106個細胞，加入1 ml Trizol，顛倒混勻，使細胞充分裂解。(2)加入0.2 ml 提RNA 的專用氯仿，顛倒混勻，室溫放置10 min，13 000 r/min、4℃離心15 min。此時，溶液分三層，上層為水相含RNA，下層為有機相含DNA，中間層主要含蛋白質。小心吸取上層水相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20 min，沉淀RNA。(3)13 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清。(4)加入75%RNA 專用酒精溶液(用DEPC 水配置)1 ml，顛倒混勻，13 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。重復洗滌沉淀一次。(5)底部白色沉淀即RNA，用吸水紙吸干。待沉淀中酒精溶液揮發(fā)完全，干燥后用無RNase DEPC 水20 μl 溶解RNA，即獲得細胞總RNA 溶液。(6)在提取的RNA 溶液中，分別加入DNA 裂解酶1 μl/100 μl，37℃，5 min 滅活。然后再加入1 μl RNA 酶抑制劑，立即進行RNA 濃度的測定和反轉錄合成cDNA，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?7)RNA 濃度和純度的測定:取2 μl RNA 溶液溶于98 μl DEPC 水中，50 倍稀釋至100 μl，吹打混勻后用紫外分光光度計進行測量OD260 和OD280的值。根據(jù)OD260 的值，計算RNA 的含量，而當OD260=1 時，即相當于40 μg/ml 的RNA。根據(jù)OD260/OD280 的值，估計RNA 的質量。(8)RNA完整性的鑒定:用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結束后將膠移至紫外燈下可以觀察到28S、18S 和5S 三條rRNA 帶型，28S 和18S 條帶比較亮，5S 條帶最不亮。通常以28S 和18S 顯色強度為2∶1，RNA 無降解，如果比值逆轉、升高或條帶模糊則表示有RNA 的降解。

1.2.2.2 cDNA 的合成 采用Promega 公司購買的反轉錄試劑盒，取大約1 μg RNA 溶液進行反轉錄，反應體系為20 μl。取Nuclease-free water 4.5 μl，MgCl24 μl，dNTP mi ×1 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，RT 酶1 μl 的混合物共計11 μl 加入EP 管中，置于冰上，然后再加入RNA 樣品4 μl(200 ng/ml)，Oligo primer 1 μl 和5 ×RT Buffer 4 μl。再25℃5 min，42℃1 h，70℃15 min，95℃10 min，4℃終止反應。即可獲得WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-細胞的cDNA 溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于半定量RT-PCR 引物設計Tab.1 Primers used for gene expression analysis by semiquantitative RT-PCR

1.2.2.3 PCR 實驗 將上述獲得的cDNA 為模板，對內參β-actin 基因片段進行克隆，按以下體系進行PCR 反應。(1)將引物稀釋到1 μmol/L，上游和下游引物各吸取1 μl。(2)cDNA 稀釋到200 ng/ml。(3)PCR 反應體系:cDNA 1 μl，10 × Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Tag 酶0.25 μl，dH2O213.25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，總體積20 μl。(4)PCR 反應條件:95℃5 min，95℃30 min，退火溫度(56.4℃，55℃)45 s，72℃40 s，30 個循環(huán)，72℃10 min，18℃終止反應。(5)為了鑒定PCR 產物，采用2%瓊脂糖凝膠電泳，如果在399 bp 處出現(xiàn)β-actin 內參條帶，證明cDNA 反轉錄成功，可以進行下面的實驗。(6)用上述反轉錄成功的cDNA 為模板克隆Hsf1 和SV40T-ag 基因片段。Hsf1 的退火溫度設計為56.4℃，SV40T-ag 的退火溫度為55℃。按上述總體積20 μl 的反應體系進行PCR 反應。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物，觀察在201 bp 和361 bp 處是否能擴增出Hsf1 和SV40T-ag 特異性目的條帶，兩種細胞是否有差異?

1.2.3 pWZL-Blast-Flag-Hsf1 質粒功能的鑒定 通過瞬時轉染的方法，將構建好的帶有Hsf1 全長基因的逆轉錄病毒載體pWZL-blast-flag-Hsf1 質粒作為實驗組，逆轉錄病毒空載體pWZL-blast 質粒作為對照組，分別用脂質體2000 轉染試劑(美國Invitrogen)轉染293T 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h。常規(guī)收細胞進行Hsf1 的Western blot 檢測，以觀察Hsf1 蛋白的表達，從而進一步判斷新轉入Hsf1 基因的功能。

1.2.4 MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的建立 將構建好的帶有Hsf1 全長基因的逆轉錄病毒載體pWZLblast-flag-Hsf1，導入產生病毒的小鼠包裝細胞293Phoenix 內，收集病毒上清，感染MEF/Hsf1-/-細胞，建立MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系。具體實驗步驟如下:(1)在20 cm2培養(yǎng)瓶正常培養(yǎng)包裝細胞293Phoenix，細胞密度達60%左右，細胞狀態(tài)好，轉染前一天換新鮮培養(yǎng)基DMEM。(2)轉染復合物的形成:分為兩組:①脂質體2000 轉染試劑9 μl，pWZL-blast-flag-Hsf1 質粒3 μg 和Pleco 質粒1.5 μg 共轉染;②脂質體2 000 轉染試劑9 μl;pWZL-blast 質粒3 μg 和Pleco 質粒1.5 μg 共轉染。上述脂質體2 000 轉染試劑和質粒分別用500 μl MEM 稀釋，充分混勻，但是不要劇烈震蕩。稀釋后的脂質體2 000室溫靜置5 min，然后與稀釋后的質?；旌衔锍浞只靹?，室溫靜置30 min，切記不要劇烈震蕩。(3)將上述制備的轉染復合物分別加入包裝細胞293Phoenix 的無血清、無雙抗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h 后換為全血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;換新的全血清DMEM 培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集含有病毒的培養(yǎng)上清。(4)將含有病毒液的培養(yǎng)基1 000 r/min，離心5 min，然后上清用0.45 mm 濾器過濾。在濾液中，加入2 μg/ml的Polybrene 試劑(美國Sigma 公司)后，直接加至生長狀態(tài)好、密度50% 左右的MEF/Hsf1-/-細胞培養(yǎng)瓶中，讓病毒液直接感染MEF/Hsf1-/-細胞。(5)感染24 h 后，加入3 μg/ml 的Blasticidine(美國Sigma 公司)殺傷3～4 d，沒有被病毒感染的MEF/Hsf1-/-細胞會被殺死。然后用2 μg/ml 的Blasticidine 作為維持量，繼續(xù)培養(yǎng)細胞。這時，Hsf1 基因應該轉入MEF/Hsf1-/-細胞中，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的重建是否成功須進一步鑒定。(6)MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的鑒定:通過Western blot 實驗檢測Hsf1 蛋白的表達，以觀察Hsf1 是否成功轉入MEF/Hsf1-/-細胞及功能如何?

1.2.5 Western blot 實驗 在WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞以及轉染Hsf1的293T 細胞中，分別加入蛋白裂解液，其中含有蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor Cocktail)(美國Sigma公司)提取細胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度(碧云天生物技術研究所)，制作蛋白樣品。通過10% SDSPAGE 電泳電轉至PVDF 膜上，PVDF 膜先用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫下封閉1 h，加一抗(Hsf1、SV40T-ag 和β-actin)于含5% 脫脂奶粉的TBST 中孵育，4℃冰箱過夜。然后加入合適的二抗孵育1 h，用ECL 顯色液顯色、曝光X 光片、拍照和分析實驗結果。

2 結果

2.1 WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細 胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞的鑒定 通過半定量RT-PCR 實驗，從轉錄水平觀察Hsf1 和SV40T-ag 基因在WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中mRNA 的表達;通過Western blot 實驗，從翻譯水平即蛋白質水平觀察Hsf1 和SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中的表達。

2.1.1 Hsf1 和SV40T-ag 基 因 在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細胞中mRNA 的表達 從圖1A 可以看出，用Trizol 試劑提取細胞總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳圖發(fā)現(xiàn)，從上到下出現(xiàn)28S、18S 和5S 三條清晰的rRNA 帶型，沒有拖帶現(xiàn)象。28S條帶最亮，大約是18S 條帶亮度的兩倍，5S 不太亮。圖中沒有出現(xiàn)基因組DNA 和蛋白質污染情況，說明提取RNA 的純度和完整性比較好，可以進行后續(xù)實驗。

利用Promega 公司反轉錄試劑盒將總RNA 立即反轉為cDNA，經過PCR 擴增后采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。圖1B 顯示，WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞在399 bp擴增出基本一致的β-actin 特異性條帶，說明通過反轉錄試劑盒反轉的cDNA 模板是成功的。

圖1C 結果顯示，Hsf1 基因在WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中擴增出特異性目的條帶，而在MEF/Hsf1-/-細胞中沒有出現(xiàn)Hsf1 基因條帶。由于在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中Hsf1基因的mRNA 表達明顯，而在MEF/Hsf1-/-細胞中表達不明顯，這說明MEF/Hsf1-/-細胞中Hsf1 基因的敲除是比較干凈的，同時也說明通過逆轉錄病毒載體轉染全長Hsf1 基因是成功的，新建MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系是成功的。

圖1D 結果表明，SV40T-ag 基因在WT/MEF 細胞、MEF/Hsf1-/-細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中均擴增出特異性目的條帶，并且SV40T-ag 基因的mRNA 表達基本一致，這也說明在轉錄水平上Hsf1 對SV40T-ag 的調控沒有影響。

2.1.2 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細胞中的表達 通過Western blot 實驗檢測WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-細胞中Hsf1 和SV40Tag 蛋白的表達。圖2 所示，Hsf1 蛋白在WT/MEF 細胞中的表達條帶非常明顯，而在MEF/Hsf1-/-細胞中的表達條帶幾乎看不到。說明在MEF/Hsf1-/-細胞中Hsf1 的敲除是比較干凈的。另外，SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細胞中的表達明顯比在WT/MEF 細胞中表達強。這也說明Hsf1 下調SV40T-ag 蛋白的表達。

綜上所述，在基因水平和蛋白水平皆證明了MEF/Hsf1-/-細胞中Hsf1 基因的敲除是比較干凈的，可以進行下面的實驗。同時也證明了Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白表達的調控，主要在翻譯水平即蛋白質水平的表達。

2.2 pWZL-blast-Flag-Hsf1 質粒的鑒定 將實驗組pWZL-blast-flag-hsf1 質粒和對照組pWZL-blast 質粒分別轉染293T 細胞，進行Hsf1 的Western blot 檢測。

圖3 結果顯示，Hsf1 蛋白在轉染pWZL-blastflag-hsf1 質粒的293T 細胞中的表達明顯比轉染pWZL-blast 質粒強得多。說明pWZL-blast-flag-hsf1質粒轉染成功，同時也說明pWZL-blast-flag-hsf1 質粒是有功能和活性的，可以繼續(xù)下面的實驗。

圖1 三種MEF 細胞中Hsf1 和SV40T-ag 基因的mRNA表達Fig.1 mRNA expression of Hsf1 and SV40T-ag gene in three MEF cell

圖2 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細胞中的表達Fig.2 Expression of Hsf1 and SV40T-ag proteins in WT/MEF and MEF/Hsf1-/-cell lines

圖3 Hsf1 蛋白在轉染pWZL-blast-flag-Hsf1 的293T 細胞中的表達Fig.3 Expression of Hsf1 protein were investigated in 293T cell of transfection with plasmid pWZLblast-flag-Hsf1

圖4 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在三種MEF 細胞中的表達Fig.4 Expression of Hsf1 protein in three MEF cell lines

2.3 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在三種MEF 細胞中的表達 通過逆轉錄病毒載體將鼠Hsf1 全長基因導入MEF/Hsf1-/-細胞中，建立MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系。為了鑒定Hsf1 基因是否轉入成功及功能如何?通過Western blot 檢測Hsf1 蛋白的表達，同時用MEF/Hsf1-/-細胞和WT/MEF 細胞作為對照。圖4 可以看出，Hsf1 在MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞表達條帶最強，WT/MEF 細胞表達也能看到清晰的條帶，而MEF/Hsf1-/-細胞不表達。這說明Hsf1 基因已經成功導入MEF/Hsf1-/-細胞，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系成功建立。MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的重建，有助于我們進一步研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導腫瘤形成中的作用。

另外，SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細胞中的表達比WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞強，在MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞中的表達最弱。這也提示我們Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白的表達調控。

3 討論

基因轉移是指用生物學或物理的手段，可將外源性基因導入受體細胞，并使其表達的一種技術。逆轉錄病毒作為載體是一種高效的、新興起的表達系統(tǒng)，可將外源性基因安全、高效、穩(wěn)定地轉入哺乳類細胞中［13，14］。而外源基因與宿主細胞基因組整合后，就可隨著細胞的分裂傳給后代。當包裝細胞被收獲后，就可以穩(wěn)定地得到含有目的載體的病毒顆粒。沒有經過包裝的病毒屬于缺陷性病毒，并不具有完整的功能。只有經過包裝細胞為其提供結構蛋白組分時，才能包裝成功能完整的病毒顆粒。當病毒顆粒感染靶細胞后，病毒顆粒是不能擴增的，安全性也是很高的［12］。而與質粒轉染外源基因等傳統(tǒng)的介導方法相比，逆轉錄病毒表達系統(tǒng)可以大大提高獲得高效表達外源基因細胞系的幾率。

轉染細胞能否表達目的基因的表型，是基因轉移成功的關鍵。本文首先將本實驗室保存的WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-細胞，進行RT-PCR 和Western blot 實驗，驗證了MEF/Hsf1-/-細胞系的Hsf1 敲除比較干凈。為了更好地研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導腫瘤形成中的作用，應用脂質體2 000轉染試劑，將含有Hsf1 基因全長的逆轉錄病毒載體pWZL-blast-flag-hsf1 轉染至能產生病毒的包裝細胞293Phoenix，將病毒上清直接進行感染MEF/Hsf1-/-細胞，用3 μg/ml 抗生素Blasticidine 殺傷細胞3～4 d，這樣沒有轉染成功的細胞被殺死，轉染成功的細胞存活下來。以后細胞培養(yǎng)用2 μg/ml 抗生素Blasticidine 進行維持，穩(wěn)定的MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系就建好了。通過Western blot 實驗檢測Hsf1 蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)，在新建細胞系Hsf1 的表達最強，而MEF/Hsf1-/-細胞的表達非常弱，說明Hsf1 成功轉染，穩(wěn)定表達Hsf1 的MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系成功建立，以進行后續(xù)的Hsf1 基因功能的實驗。

另外，我們也在基因水平和蛋白質水平，分別通過RT-PCR 和Western blot 實驗觀察了SV40T-ag 的表達，結果發(fā)現(xiàn)SV40T-ag 基因在WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-細胞中的表達沒有差異;SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細胞表達強于WT/MEF 細胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞。初步推測Hsf1 對SV40Tag 的調控作用不在基因水平，主要在翻譯水平即蛋白質水平的表達。

總之，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細胞系的重建，有助于進一步研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導腫瘤形成中的作用提供實驗模型。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白的表達調控，尚需進行更深入的探討。

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