牛病毒性腹瀉病毒E2截短基因重組卡介苗安全性和最佳免疫劑量的研究

楊宇航，李 晶，張 云，郝俊偉，劉東旭，時 坤，李健明，曾范利杜 銳．2＊

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118；2．教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實驗室，吉林省藥用動物二級實驗室，吉林長春130118）

牛病毒性腹瀉病毒E2截短基因重組卡介苗安全性和最佳免疫劑量的研究

楊宇航1，李 晶1，張 云1，郝俊偉1，劉東旭1，時 坤1，李健明1，曾范利1杜 銳1．2＊

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118；2．教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實驗室，吉林省藥用動物二級實驗室，吉林長春130118）

將6組BVDV－E2截短基因重組卡介苗用生理鹽水稀釋，分別進(jìn)行革蘭染色和伊紅美藍(lán)平板檢測，6組重組卡介苗均無雜菌污染。再對6周齡～8周齡雄性豚鼠進(jìn)行免疫接種，每只腹腔注射1 m L（5×106cfu／只），免疫接種豚鼠無任何癥狀，精神、食欲、排便及發(fā)育等均不受影響，且無死亡，說明重組病毒對試驗豚鼠是安全的。使用BVDV抗體檢測試劑盒對60頭健康牛的母源抗體含量進(jìn)行檢測，不含母源抗體占85．00%。取重組卡介苗中的一組，用生理鹽水稀釋，使重組卡介苗達(dá)到105、106、107、108、109cfu／m L共5組，每組不含母源抗體的牛3頭，免疫接種前對每頭牛進(jìn)行尾頸靜脈采血，析出血清，用BVDV抗體檢測試劑盒測牛血清中抗體水平。采完血后對牛進(jìn)行皮下免疫接種，4周后，采取血液，檢測牛血清中抗體水平。通過免疫接種后的檢測結(jié)果可知，重組疫苗對牛最佳免疫劑量為108cfu／m L，為進(jìn)一步進(jìn)行重組疫苗回歸本動物的免疫效果研究提供了可靠依據(jù)。

牛病毒性腹瀉病毒；E2截短基因；重組卡介苗；最佳免疫劑量；安全性

牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine vival dirrhea virus，BVDV）所致的一種廣為傳播的傳染病，以消化道黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉為主要特征［1］。該病呈世界性分布，牛、鹿、羊、豬和馬等［2－3］均有不同程度的感染。在國內(nèi)外基本應(yīng)用弱毒疫苗或滅活疫苗防控該病，雖然弱毒疫苗的免疫效果較好，但弱毒株的毒力易返強(qiáng)［4］，對一些極易感動物存在一定的危險性，其免疫效果易受多種因素的影響。因此，研究重組疫苗為防控牛病毒性腹瀉提供了可能路徑。為篩選出既安全又有效的重組疫苗，本試驗測定BVDV－E2截短基因重組卡介苗的安全性和最佳免疫劑量。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗用動物 6周齡～8周齡雄性豚鼠共70只，每只豚鼠體重約18 g～20 g，購于長春實驗動物繁育場；24月齡左右的健康牛60頭，選取于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧教研基地。

1．1．2 重組卡介苗 BVDV－E2截短基因重組卡介苗由經(jīng)濟(jì)動物疫病實驗室構(gòu)建保存。

1．1．3 試劑與儀器 HRP標(biāo)記的鼠抗牛酶標(biāo)二抗為BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板為Tecan公司產(chǎn)品；BVDV抗體檢測試劑盒為北京祥龍環(huán)宇生物有限公司產(chǎn)品；碘液、乙醇、蕃紅等革蘭染色和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基等。

1．2 方法

1．2．1 重組卡介苗安全性的測定 取BVDV－E2截短基因重組卡介苗進(jìn)行革蘭染色和伊紅美藍(lán)平板檢測。取6組BVDV－E2截短基因重組卡介苗，用生理鹽水稀釋。對6周齡～8周齡雄性豚鼠進(jìn)行腹腔注射，每組10只，每只接種1 m L（5×106cfu／只）［5］，作為空白對照，接種后觀察豚鼠的精神狀態(tài)、食欲、排便以及死亡情況。

1．2．1．1 革蘭染色法 略。

1．2．1．2 伊紅美藍(lán)鑒定法 ①制作伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。②6組重組卡介苗分別取100μL接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，再接種100μL的大腸埃希菌作對照組，用涂抹棒涂抹均勻。③將涂抹好的培養(yǎng)皿倒置37℃溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h后觀察生長情況。

1．2．2 母源抗體檢測 隨機(jī)采取60頭24月齡左右的健康牛3 m L～5 m L血液，析出血清，使用BVDV抗體檢測試劑盒檢測血清中抗體含量，并與陰、陽性血清的抗體含量進(jìn)行比較。

1．2．3 最佳免疫劑量的測定 將18頭牛隨機(jī)分成6組，每組3頭，分別為A組、B組、C組、D組、E組、生理鹽水對照組。取一組BVDV－E2截短基因重組卡介苗進(jìn)行免疫接種，其中A、B、C、D、E各組分別皮下免疫接種105、106、107、108、109cfu／m L BVDVE2截短基因重組卡介苗，對照組不進(jìn)行處理。在免疫接種前，對每頭牛進(jìn)行頸靜脈采血5 m L～10 m L，置于5 m L離心管中析出血清，按耳牌對號標(biāo)記，用BVDV抗體檢測試劑盒檢測牛血清中抗體水平。按照上述劑量進(jìn)行免疫，免疫4周后，頸靜脈采血5 m L～10 m L，置于離心管中析出血清，對號標(biāo)記，用BVDV抗體檢測試劑盒檢測牛血清中抗體水平。1．2．4 BVDV抗體檢測試劑盒使用方法 所有的試劑盒組分在使用之前都必須恢復(fù)到室溫（18℃～25℃）。①取出用BVDV抗原包被的微量反應(yīng)板，樣品檢測區(qū)、陰、陽性對照組均做好標(biāo)記；②在樣品檢測區(qū)加入100μL被檢血清樣品，每組3個平行對照；③在陰、陽性對照組的小孔中各加入100μL陰、陽性血清，在37℃溫箱孵育1 h；④在不棄去血清樣品的情況下，每孔加入50μL稀釋好的過氧化物酶標(biāo)記物，使每個小孔都能輕輕的混勻，在37℃溫箱孵育1 h；⑤用稀釋好的洗滌液洗滌微量反應(yīng)板5次，3 min／次～5 min／次，扣干。⑥加入底物溶液100μL／孔，室溫避光作用10 min～15 min，加入終止液50μL／孔。⑦酶標(biāo)儀調(diào)零，在加入終止液5 min內(nèi)于450 nm單波長測定被檢樣品和對照組的吸光度（OD）值。⑧以O(shè)D 450 nm＜0．4為陽性血清，OD 450 nm＞0．8為陰性血清，統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 重組卡介苗的安全性試驗

2．1．1 革蘭染色檢測結(jié)果 6組BVDV－E2截短基因重組卡介苗通過革蘭染色后，染色反應(yīng)既無紫色，又無紅色，說明此6組重組卡介苗無雜菌污染。

2．1．2 伊紅美藍(lán)平板檢測結(jié)果 6組BVDV－E2截短基因重組卡介苗進(jìn)行美藍(lán)平板涂板，經(jīng)37℃溫箱培育24 h，6組重組卡介苗均無細(xì)菌生長，而涂有大腸埃希菌的對照組長出菌落，說明此6組重組卡介苗中沒有感染大腸埃希菌。

2．1．3 重組卡介苗豚鼠注射試驗結(jié)果 6組重組卡介苗接種試驗豚鼠后，剛開始有些躁動不安，1 d后便好轉(zhuǎn)，接種疫苗7 d～14 d后，所有試驗豚鼠均無明顯的全身癥狀，精神、食欲、排便正常，持續(xù)生長。

2．2 牛免疫接種前母源抗體的檢測

由表1可以看出，應(yīng)用BVDV抗體檢測試劑盒對60頭牛的母源抗體進(jìn)行檢測，以O(shè)D 450 nm＜0．4為陽性血清，OD 450 nm＞0．8為陰性血清，對照組陽性血清 OD 450 nm 為0．250 9，陰性血清 OD 450 nm為1．589 4，空白組 OD 450 nm 為0．051 2。被檢血清陽性血清2份，陰性血清51份，陰性占有率為85．00%，即被檢測的60頭牛不含母源抗體的比例為85．00%。

2．3 重組卡介苗最佳免疫劑量的確定

由表2可以看出，通過ELISA檢測牛體內(nèi)抗體水平變化，從A組～D組抗體水平一直隨免疫劑量增加而升高，在D組的差值0．170 4最大，在D組之后開始下降，而生理鹽水組基本沒變化，因此，抗體水平在D組時免疫效果最好，達(dá)到了最大值，即BVDV－E2截短基因重組卡介苗免疫牛的最佳免疫劑量為108cfu／m L。

3 討論

革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，其能夠縮小細(xì)菌的鑒定范圍，有利于進(jìn)一步分離鑒定，并能對疾病做出診斷。該方法通過對細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分染色，具有較好的敏感性。在革蘭染色過程中，脫色是否完全決定實驗的成敗，脫色不完全易造成假陽性［6］，而脫色過度又容易造成假陰性，因此脫色時間必須掌握得當(dāng)。6段重組卡介苗染色后，既無紫色又無紅色呈現(xiàn)在視野中，說明這6組重組卡介苗中無雜菌污染。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是酸堿染料結(jié)合使用，對嗜酸性菌有一定的敏感性，而對一些嗜堿性菌有抑制作用，其常用來鑒別大腸埃希菌是否存在。在配制伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基時，20 g／L伊紅水溶液和5 g／L美藍(lán)水溶液要求的量特別少，配置起來有點(diǎn)費(fèi)事。通過伊紅美藍(lán)平板平培養(yǎng)，未形成無黑色菌落，說明這6組重組卡介苗中沒有被大腸埃希菌污染。豚鼠對結(jié)核分支桿菌、大腸埃希菌等多種病原體敏感，經(jīng)常用于各種病原菌的分離、鑒別、診斷，同時也是各種抗病藥物篩選以及病理研究的最佳動物［7］。用6段重組卡介苗免疫豚鼠，豚鼠均沒有明顯的全身反應(yīng)，精神、食欲、排便正常，生長發(fā)育正常，且無豚鼠死亡。綜合評價，6段截短基因重組卡介苗是安全的。

本試驗應(yīng)用BVDV抗體檢測試劑盒對牛的母源抗體進(jìn)行檢測，檢出陰性血清51份，陰性率為85．00%。為后續(xù)6組BVDV－E 2截短基因重組卡介苗免疫牛進(jìn)行免疫效果評價奠定基礎(chǔ)。牛接種重組卡介苗后抗體水平變化表明，A組、B組、C組、D組、E組等試驗組的抗體水平明顯高于生理鹽水組抗體水平，說明BVDV－E2截短基因重組卡介苗對控制牛病毒性腹瀉病是有一定的效果。當(dāng)每頭牛最佳免疫劑量達(dá)到108cfu／m L時，抗體含量就達(dá)到了峰值，隨著接種劑量的增加，抗體水平有下降趨勢，因此，從牛免疫后抗體水平變化來看，每頭牛免疫接種108cfu／m L是最佳免疫劑量。

表1 BVDV母源抗體檢測Table 1 BVDV maternal antibody detection

表2 牛免疫后抗體水平變化Table 2 Antibody level changes in the cattle after immunication

當(dāng)前，卡介苗免疫預(yù)防作為一種常用于控制牛病毒性腹瀉的方法，由于其長期使用及劑量的不斷增加，動物體內(nèi)已產(chǎn)生藥物殘留［8］及高度的耐受性與抗藥性［9］。隨著時間的推進(jìn)，卡介苗單位用量越來越大，但免疫效力卻越來越低。近年來，研究開發(fā)重組卡介苗與基因缺失疫苗［10］已成為時下的熱點(diǎn)，許多學(xué)者都在致力于重組卡介苗的構(gòu)建和免疫原性分析方面的研究，使其具有多價疫苗的效果，并解決重組卡介苗的穩(wěn)定性等問題［11－12］。本試驗是在構(gòu)建的重組卡介苗基礎(chǔ)上，鑒定其安全性，并通過免疫接種牛來確定重組卡介苗的最佳免疫劑量，為檢測重組卡介苗的免疫效果及相關(guān)重組卡介苗的研制提供依據(jù)。重組卡介苗免疫接種牛病毒性腹瀉效力的提高，為預(yù)防牛病毒性腹瀉提供了可靠途徑，同時為疫苗的推廣使用和專利申請奠定了基礎(chǔ)，以保障我國養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。

［1］ 陳溥言．獸醫(yī)傳染病學(xué)［M］．5版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：275－278．

［2］ Jonese L R，Weber E L．Application of single strand conformation polymorphism to the study of bovine viral diarrhea virus isolates［J］．J Vet Diagn Invest，2001，13：50－56．

［3］ 王先煒，習(xí)向峰，季 偉，等．豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗最小免疫保護(hù)劑量研究［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（9）：723－726．

［4］ Colditz G A，Brewer T F，Berkey C S，et al．Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis．Meta analysis of the published literature［J］．JAMA，1994，271（9）：698－702．

［5］ 張 夢．BVDV－E2基因在BCG中的優(yōu)化表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物免疫效果的研究［D］．吉林長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：37．

［6］ 崔瀟婷，洪偉鳴，王妲妲．革蘭氏染色技術(shù)的實驗研究［J］．考試周刊，2012，73：159．

［7］ 李 萌，魏肖云，戴啟剛，等．變應(yīng)性鼻炎動物模型的研究現(xiàn)狀［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（12）：1360－1363．

［8］ Francisca C V，Annemarie B，Arjan S J，et al．Transmission of a liveEimeriaacervulinavaccine strain and response to infection in vaccinated and contact－vaccinated broilers［J］．Vaccine，2012，30（2）：322－328．

［9］ 李 瑾，黃炳成．基因重組卡介苗研究進(jìn)展［J］．中國熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9（1）：160－162．

［10］ Karuppannan A K，Jong M H，Lee S H，et al．Attenuation of porcine circovirus 2 in SPF piglets by abrogation of ORF3 function［J］．Virology，2009，383（2）：338－347．

［11］ 陳向東，吳梧桐．重組卡介苗的研究與應(yīng)用［J］．藥學(xué)進(jìn)展，2003，27（5）：259－263．

［12］ 陶 冬，周 然，王 丹，等．柔嫩艾美耳球蟲F2株弱毒疫苗最佳免疫劑量和安全性的研究［J］．動物保健品，2013（3）：120－122．

Studies on Safety and Optimal Immune Dose of BVDV－E2 Truncated Gene RBCG

YANG Yu－h(huán)ang1，LI Jing1，ZHANG Yun1，HAO Jun－wei1，LIU Dong－xu1，SHI Kun1，LI Jian－ming1，ZENG Fan－li1，DU Rui1，2

（1．JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin，130118，China；2．KeyLaboratoryofAnimalProduction，Product QualityandSecurity，MinistryofEducationofthePeople＇sRepublicofChina，Level2Laboratoryof MedicalAnimalofJilinProvince，Changchun，Jilin，130118，China）

In this experiment，6 groups of BVDV－E2 truncated gene recombinant BCG which had been diluted with normal saline were tested by Gram stain and eosin methylene blue plate detection respectively，the result showed no bacterial infection．Then the 6－8－week－old male Guinea pigs were immunized intraperitoneally with 1m L（5×106cfu）recombinant BCG each one．All of the Guinea pigs had no any systemic symptoms and their spirit，appetite，feces and growth etc．were not affected，and no deaths，which proved that the recombinant BCGs were safe to the Guinea pigs．The levels of maternal antibodies of 60 healthy cows were detected with the BVDV antibody detection kit and the proportion that had no maternal antibodies was 85．00%．Then one group of recombinant BCG was diluted with saline to make the amount of recombinant BCG to 105，106，107，108，109cfu／m L respectively．Subsequently，three 24－month－year－old cows which had no maternal antibodies were immunized with each dose．Before immunization，every cow＇s blood were collected from tail vein，for testing the level of antibody in the serum with the BVDV antibody detection kit．The subcutaneous immunization was made after the blood was collected．Four weeks later，the blood was collected again for seral antibody detection．The result showed that the optimal immune dose of recombinant vaccine was 108cfu／m L，which provided a reliable basis to study the immune effect of the recombinant vaccine when it was applied to the original animals．

Bovine viral diarrhea virus；E2 truncated gene；recombinant BCG；optimal immune dose；safety

S852．659．6

A

1007－5038（2014）07－0034－04

2013－12－09

國家自然科學(xué)基金項目（31372436）；國家科技支撐計劃項目（2011BAI03B02－1）；吉林省科技創(chuàng)新人才培育

計劃項目（20130521023JH）；吉林省科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計劃項目（20125067）

楊宇航（1987－），男，陜西富平人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)動物疾病學(xué)研究。＊通訊作者