Cox-2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

孟 韜 張大偉 劉林濤 吳 娜 楊曉波

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130000)

結(jié)直腸癌(CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率逐年上升。由于術(shù)前早期診斷較為困難，術(shù)后判斷復(fù)發(fā)困難，對CRC的化療效果也不十分滿意。環(huán)氧化酶(COX)是一種雙功能酶，是花生四烯酸代謝為前列腺素類的關(guān)鍵限速酶。COX-2是COX中的一個亞型，在正常組織和情況下不表達(dá)，但可被廣泛的血管內(nèi)外激活物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生，與CRC的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選自吉林省人民醫(yī)院肛腸科2010年1月至2012年5月CRC手術(shù)標(biāo)本50例，分別取淋巴轉(zhuǎn)移癌組織30例，未轉(zhuǎn)移癌組織20例，正常結(jié)腸黏膜組織10例，正常的結(jié)腸黏膜組織取自遠(yuǎn)離CRC組織10 cm以上處，并在術(shù)后1 h內(nèi)將標(biāo)本歸類分組存于液氮。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均行CRC根治術(shù)，標(biāo)本由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師給出病理診斷并統(tǒng)計；(2)所有病例均具有完善的臨床資料并由專業(yè)人員統(tǒng)計；(3)術(shù)前未經(jīng)放化療等系統(tǒng)治療；(4)沒有其他惡性并發(fā)癥；(5)術(shù)前未經(jīng)非甾體抗炎藥(NSAIDs)治療。其中男33例，女17例。年齡35～84(平均60)歲。組織學(xué)類型均為腺癌。腫瘤直徑<5cm 22例，腫瘤直徑≥5cm 28例。TNM分期參照2009年UICC、AJCC CRC TNM分期(第7版)，其中T1和T2期10例，T3期30例，T4期10例。50例CRC標(biāo)本中，術(shù)前癌胚抗原(CEA)表達(dá)陽性42例，陰性8例。分化程度：高分化(含高-中分化)腺癌16例，中分化腺癌25例，低分化(含中-低分化)腺癌9例。有淋巴轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)、神經(jīng)、脈管侵犯)25例。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑Trizol美國進(jìn)口；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連Takara公司；熒光染料試劑盒購于大連Takara公司。LightCycler Real-time PCR擴(kuò)增儀(Roche Diagnostics公司，瑞士)；高速臺式離心機(jī)：湘雅儀表廠；紫外分光光度儀(LKB.BIOCHROM.ULTROSPEC Ⅱ，日本)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)結(jié)直腸癌病例的病理結(jié)果，以是否有淋巴轉(zhuǎn)移為分組標(biāo)準(zhǔn)，分為淋巴轉(zhuǎn)移癌組織30例，未轉(zhuǎn)移癌組織20例，正常結(jié)腸黏膜組織10例。

1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟 Trizol法提取組織總RNA；逆轉(zhuǎn)錄(RT)；Real Time PCR 反應(yīng)。

1.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，熔解曲線證實(shí)產(chǎn)物中不存在二聚體。使用LightCycler Software4.0(Roche)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用2-△△CT的方法分析各基因相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

Real time PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在癌旁結(jié)直腸正常黏膜組織(表達(dá)量設(shè)為1)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌(表達(dá)量3.5±0.8)與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌(表達(dá)量7.2±0.9)三組之間COX-2表達(dá)水平有明顯差異(P<0.05)。COX-2基因表達(dá)從結(jié)直腸正常黏膜組織→無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌組織→有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌組織呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，各個階段兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

大量的流行病學(xué)研究證實(shí)，NSAIDs具有明顯的降低CRC發(fā)病率及病死率的作用。而經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs類藥物主要是通過抑制COX-2來發(fā)揮作用的。

COX又稱為前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，兼有環(huán)氧化酶活性和過氧化氫酶活性，是生成前列腺素的關(guān)鍵限速酶。COX-2于1989年由Simmons等發(fā)現(xiàn)。在正常情況下，C0X-2除在腦、腎等器官表達(dá)很少量之外，其他器官基本上不表達(dá)，但在細(xì)胞外因子、癌基因或者致癌物的刺激下能迅速產(chǎn)生〔1〕。

目前監(jiān)測COX-2表達(dá)水平有以下三種方法：(1)直接測定COX-2蛋白的表達(dá)，如免疫組化、Western-印跡；(2)直接測定COX-2的基因表達(dá)，如Reverse-Transcription Polymerase Chain Reactin(RT-PCR)、Northern blots；(3)通過檢測COX-2相關(guān)酶和COX-2產(chǎn)物后間接測定COX-2的表達(dá)，比如通過檢測PGE2量來測定COX-2的表達(dá)。此法所獲得數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確，不足之處就是對標(biāo)本的要求較高，費(fèi)用也比單純免疫組化昂貴。

Sano等〔2〕研究指出COX-2蛋白在正常結(jié)腸黏膜組織、結(jié)腸腺瘤、CRC中的表達(dá)逐漸增高。徐菁等〔3〕研究指出COX-2與CRC的Dukes分期和是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與其組織分化程度無關(guān)。本研究結(jié)果提示COX-2有促進(jìn)CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能，即過表達(dá)COX-2的CRC具有更強(qiáng)的侵襲性，這為判斷CRC是否發(fā)生轉(zhuǎn)移和預(yù)后提供了一種重要的思路。

Eberhart等〔4〕發(fā)現(xiàn)，COX-2可上調(diào)腫瘤細(xì)胞CD44的表達(dá)，CD44可以促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，從而促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移。Tamazawa等〔5〕發(fā)現(xiàn)COX-2可促進(jìn)CRC細(xì)胞向基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附而增進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。提示COX-2可直接通過改變腫瘤細(xì)胞表型來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔4〕。高表達(dá)的COX-2可產(chǎn)生大量的PGE2，具有免疫抑制作用，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)了CRC的發(fā)生發(fā)展。Masunaga等〔6〕發(fā)現(xiàn)了COX-2與毛細(xì)血管密度(MVD)顯著相關(guān)，MVD和腫瘤發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，提示COX-2和CRC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。COX-2可促進(jìn)促血管生長因子(VEGF)表達(dá)〔7〕，而VEGF可促進(jìn)腫瘤新生血管形成，新生的毛細(xì)血管基底膜不連續(xù)，腫瘤細(xì)胞易于突破，最終促成了腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移〔8〕。

淋巴轉(zhuǎn)移仍是大多數(shù)上皮來源的腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑，但目前對惡性腫瘤如何發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及影響因素仍不太明確。Dhar等〔9〕利用轉(zhuǎn)染了COX-2基因的CRC細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高VEGF-C的表達(dá)，而利用COX-2特異性抑制劑則能降低VEGF-C的表達(dá)。VEGF-C是人類發(fā)現(xiàn)的第一個淋巴管生長因子，是血管VEGF的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C與多種腫瘤的淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。胡玉林等〔10〕發(fā)現(xiàn)在未發(fā)生淋巴管浸潤或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組中VEGF-C表達(dá)率均顯著低于發(fā)生了淋巴管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組。VEGF-C通過與淋巴管上的特異性受體VEGFR-3結(jié)合后促進(jìn)腫瘤淋巴管生成并改變淋巴通路通透性，從而促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移〔11〕。COX-2的過表達(dá)可以促進(jìn)VEGF-C在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，從而促進(jìn)了CRC的淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

COX-2全程參與從結(jié)腸正常黏膜-CRC-CRC轉(zhuǎn)移變化的整個過程，在這多步驟、多階段的變化過程中發(fā)揮了重要的作用。轉(zhuǎn)移性的CRC過表達(dá)COX-2，而高表達(dá)的COX-2則可促進(jìn)CRC淋巴管的生成和淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。研究揭示了COX-2與CRC的相互關(guān)系及作用機(jī)制能夠幫助人類認(rèn)識腫瘤的本質(zhì)，研制針對COX-2的特異性藥物能夠降低COX-2的表達(dá)，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，顯著的降低CRC的發(fā)生率及病死率〔12〕，這些都具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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