提高CpG ODN 免疫效價方法的研究進展

王 旋 王樹平 丁子清 申玉芹 于海蛟 周 岳 林崇韜

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，吉林 長春 130021)

1995年Krieg 等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)CpG二寡聚核苷酸(ODN)是病原體 DNA 免疫刺激活性的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)并等將這類含有非甲基化CpG的特定結(jié)構(gòu)稱為CpG 基序，也有學(xué)者稱其為免疫刺激序列。其中，組成CpG ODN胞嘧啶的第五位碳原子必須是非甲基化的，正是因為這種結(jié)構(gòu)，使CpG ODN 具有免疫刺激活性作用,換言之，這也是CpG ODN 免疫刺激活性的核心結(jié)構(gòu)。具有這種結(jié)構(gòu)的CpG ODN能被Toll樣受體(TLR9)特異性識別，通過TLR9的識別作用啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。由CpG ODN引起的免疫刺激活性作用是明顯且多樣化的，其主要作用包括：(1)直接刺激漿細胞樣樹突細胞(pDCs)：通過促進pDCs成熟并使其分泌大量的IL-12 、細胞共刺激分子CD86及少量的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6。但是，Chen等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)：長期給予樹突狀細胞CpG ODN刺激能抑制其成熟。Tu等〔3〕研究證實，應(yīng)用抗CD81單克隆抗體作用于CpG ODN誘導(dǎo)的人肝內(nèi)pDCs，可以抑制pDCs成熟、分化，抑制pDCs分泌 TNF-α及負向調(diào)節(jié)CD80、CD86的表達。(2)直接刺激B細胞：與外界或宿主雙鏈DNA引起的B細胞免疫應(yīng)答不同，治療應(yīng)用的單鏈CpG ODN能促進B細胞的分裂增殖，促使其分泌IL-6、CD86〔4〕。(3)間接激活NK 細胞和T細胞，調(diào)控Th1/Th2免疫應(yīng)答和增強血液循環(huán)系統(tǒng)中補體的活化等〔5〕。

由于TLR9識別CpG ODN后，能誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，因此CpG ODN在感染性疾病〔6〕、過敏性疾病〔7〕、癌癥〔8〕的治療中有廣泛的應(yīng)用前景。因此，多種多樣的CpG ODN被研究設(shè)計。但是，由于游離的CpG ODN進入機體后存在許多缺陷，如在體內(nèi)存在時的不穩(wěn)定性、毒性、不理想的藥物動力代謝和缺乏靶細胞特異性且細胞攝取率低，使其臨床應(yīng)用仍然面臨許多障礙。因此，一些學(xué)者嘗試通過改良CpG ODN的骨架結(jié)構(gòu)或者使用遞呈載體來克服上述障礙，該文就這些學(xué)者在這兩方面的研究進展作一綜合分析。

1 CpG ODN改良骨架結(jié)構(gòu)及其免疫刺激活性的影響

1.1骨架的長度 實驗研究表明，含CpG 基序但堿基數(shù)目少于8個的ODN不存在活性。只有當(dāng)骨架之中含有18～25個堿基且含有非甲基化的CpG基序時，ODN才可以較好地發(fā)揮其免疫刺激活性作用。

1.2骨架的化學(xué)修飾

1.2.1骨架的硫代化修飾 硫代化修飾是寡聚脫氧核苷酸骨架修飾中最常見、應(yīng)用最廣泛的化學(xué)修飾,把磷酸二酯骨架中一個非橋聯(lián)氧原子用硫原子取代的過程。因為磷酸硫代化修飾的ODN可抵抗體內(nèi)核酸酶的消化作用〔9〕,這將有利于ODN在體內(nèi)穩(wěn)定存在，此外還可以增加細胞對ODN的攝取率,從而提高其免疫效價。研究證實〔10〕,當(dāng)硫代磷酸酯骨架CpG ODN(PS-ODN)的濃度僅為磷酸二酯骨架CpG ODN (PO-ODN)的1/10～1/100 h，即可表現(xiàn)出相當(dāng)強度的免疫刺激活性,如誘導(dǎo)NO分泌、TNF-α生成、活化IL-12啟動子等。而且，骨架全部被硫代化修飾較骨架部分被修飾的CpG ODN表現(xiàn)出更強的免疫刺激活性作用。到目前為止，臨床試驗所使用的CpG ODN，如ODN 2216,ODN 2006,ODN 2395均為PS-ODN。

國內(nèi)外多篇文獻報道〔11〕，PS-ODN可能引起嚴重的短期或長期副作用。研究發(fā)現(xiàn)，將PS-ODN注射于小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)，可引起小鼠以單核細胞聚集和TNF-α高表達為特征的膝關(guān)節(jié)炎；將PS-ODN通過靜脈注射于獼猴體內(nèi)，可使其體內(nèi)補體過度激活從而引起急性中毒等。研究表明，PS-ODN所引起的毒副作用是由于被修飾的骨架與非特異性的聚陰離子及血清蛋白混雜結(jié)合引起的，與CpG基序不存在依賴關(guān)系。

1.2.2天然骨架的模擬 PO-ODN能較真實的模擬天然CpG ODN與TLR9相互作用〔12〕。PO-ODN發(fā)揮的免疫刺激活性作用與PS-ODN比較，存在顯著差異。PO-ODN作用存在于外周血單核細胞和B細胞中TLR9時產(chǎn)生IL-6引起的免疫反應(yīng)與CpG基序呈依賴性，而PS-ODN誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6則呈CpG基序非依賴性〔13〕。同時，Meng等〔15〕發(fā)現(xiàn)PO-ODN高濃度時不存在免疫抑制效應(yīng)，而PS-ODN在較高的濃度時卻表現(xiàn)出一定的免疫抑制效應(yīng)。此外，CpG 基序遠中序列的微小變化能引起PS-ODN免疫刺激活性的改變，但此種微小序列變化對PO-ODN免疫刺激活性沒有影響。Roberts等〔14〕研究表明，在ODN末端增加脫氧鳥苷殘基時，通過延遲MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可使PS-ODN免疫刺激活性降低，但是這種改變對PO-ODN的免疫刺激活性完全沒有影響。雖然，PO-ODN與PS-ODN相比存在諸多優(yōu)勢，但是體內(nèi)及體外實驗〔15〕均證實，在血漿溶液中，PO-ODN由于核酸外切酶的作用可被快速降解，導(dǎo)致其不能激活TLR9而產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，因此PO-ODN的應(yīng)用仍然受到限制。

1.2.3骨架的立體化學(xué)修飾 近些年許多學(xué)者致力于研究CpG ODN 的立體化學(xué)修飾。由于ODN的降解主要由核酸外切酶作用完成，因此使僅含磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)的ODN成為類似質(zhì)粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可免受降解這一觀點得到了大家廣泛的認可。有研究表明，由3條簡單ODN鏈自然形成的Y型ODN(Y-ODN)可在免疫作用被激活時產(chǎn)生TNF-α和IL-6,同時這種結(jié)構(gòu)可提高細胞的攝取率，但是不能抵抗核酸酶的降解作用。Rattanakiat等〔16〕設(shè)計出樹枝狀DNA(DL-DNA)，此種設(shè)計是通過將Y-DNA與CpG基序相耦合形成，由于此種類型可有效抵抗核酸酶的降解，因此可有效提高免疫效價。Nishikawa等〔17〕通過實驗證明，包含CpG基序和完全由磷酸二酯骨架構(gòu)成的X型CpG ODN(X-ODN)可以刺激RAW 264.7細胞，抵抗核酸酶降解的同時，在8 h內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)TNF-α的釋放，說明X-ODN具有較強的免疫刺激活性。Li等〔18〕合成四面體結(jié)構(gòu)的CpG ODN，能在血漿中穩(wěn)定保持8 h以上而不被降解，當(dāng)被巨噬細胞樣細胞高效攝取后，可通過TLR9識別激活誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量TNF-α、IL-6等因子。

目前更多學(xué)者在設(shè)計具有免疫刺激活性的CpG ODN時，傾向于既能保障CpG ODN不被核酸外切酶快速降解，同時又可以提高細胞的攝取率，因此盡可能設(shè)計為PO-ODN來獲得最佳治療效果同時使毒副作用降到最低。

2 遞呈載體對CpG ODN免疫刺激活性的影響

游離的CpG ODN在機體內(nèi)易被核酸外切酶快速降解，而且細胞對其攝取率較低，因此大大降低了其免疫效價?；诖?，為了避免CpG ODN被快速降解，使其順利到達靶細胞，同時促進細胞的攝取，許多學(xué)者將CpG ODN進行了一些預(yù)處理。通常情況，可以通過與其他佐劑共同使用來提高CpG 佐劑活性〔19〕。微生物病原體引起的免疫應(yīng)答較CpG ODN更強烈，可能是因為微生物病原體表達多種PRRs，從而在一定時間范圍內(nèi)可以同時或者有序的活化多種TLRs以及其他識別受體。因此，一些學(xué)者嘗試聯(lián)合使用多種TLR激活劑來增強CpG ODN免疫應(yīng)答從而獲得更強的抗感染能力。除此之外,遞呈載體技術(shù)的應(yīng)用，不僅解決了體內(nèi)降解的問題，而且還有效提高了細胞對CpG ODN的攝取率。

2.1陽離子脂質(zhì)體遞呈載體 脂質(zhì)體是一種臨床應(yīng)用較早且發(fā)展最為成熟的一類靶向藥物載體，具有安全、緩釋和可生物降解等特點。作為載體的脂質(zhì)體可以單獨遞呈CpG ODN，也可以在保證佐劑CpG ODN與抗原親和性不變的情況下同時遞呈兩者。脂質(zhì)體能直接將CpG ODN運送至靶細胞，增加CpG ODN的提呈效率，同時通過改善藥物代謝動力學(xué)及生物學(xué)分布，來降低毒性，增加安全性。含CpG ODN的脂質(zhì)體微粒經(jīng)淋巴、皮膚、皮下注射和滴鼻4種途徑進入體內(nèi)時，IgG2a滴度及遞呈細胞攝取率都有不同程度提高，說明含CpG ODN的脂質(zhì)體微粒有廣泛的適用范圍〔20〕。此外，經(jīng)大量動物實驗研究證實，以脂質(zhì)體作為遞呈載體的CpG ODN免疫刺激活性和免疫預(yù)防及治療效果均有明顯提升。Puangpetch等〔21〕將CpG ODN包裹于陽離子脂質(zhì)體中，免疫作用雄性BALB/c 小鼠，同時用類鼻疽桿菌感染小鼠，實驗結(jié)果顯示,脂質(zhì)體包裹組與裸CpG ODN組小鼠相比，能夠產(chǎn)生更好的免疫保護力，30 d內(nèi)的抗感染率高達100%，死亡率明顯下降。Golali等〔22〕運用脂質(zhì)膜預(yù)備方法將CpG ODN和可溶的利什曼原蟲抗原包裹于脂質(zhì)體中，免疫作用BALB/c 小鼠，攻毒試驗結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包裹組小鼠IgG2a/IgG1 、IgG的表達明顯提高，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生了高水平的干擾素(IFN)-γ、IL-4。

2.2陽離子聚合物遞呈載體 陽離子聚合物也可以作為CpG ODN遞呈載體，如：殼聚糖、聚乙交脂丙交酯(PLG)聚合物等，他們通過正負電荷吸引結(jié)合使含CpG ODN的顆粒體積變小,從而不被核酸酶降解，進而增強ODN作為免疫佐劑的免疫應(yīng)答作用〔23〕。在小鼠實驗中，殼糖體聚合物作為遞呈載體包裹豬IL-6基因和CpG ODN可有效提高CpG ODN的免疫刺激活性。眾所周知，PLG具有良好的生物相容性和生物可降解性。破傷風(fēng)類毒素與CpG ODN通過PLG納米顆粒共傳遞可使CpG ODN佐劑用量明顯減少，從而可以減小由于佐劑用量較大而引起毒副作用的可能性。小鼠實驗研究也表明，用陽離子PLG聚合物包裹的豬副傷寒疫苗和CpG ODN同研究中的對照組比較，被包裹組顯示出更強的免疫刺激效應(yīng)。

2.3納米級顆粒遞呈載體 研究表明，pDCs和吞噬細胞可通過吞噬或內(nèi)吞作用攝取納米至微米級的顆粒，因此，除了研究將脂質(zhì)體或陽離子聚合物作為遞呈系統(tǒng)外，許多學(xué)者將研究對象轉(zhuǎn)移到納米級顆粒上。CpG ODN可以與親脂性分子-膽固醇在水溶液中凝集結(jié)合形成膽固醇-CpG ODN(Chol-CpG ODN)納米級顆粒，這樣可增加CpG ODN在血清中的穩(wěn)定性〔24〕。同時，Chol-CpG ODN能與脂性蛋白如：脂蛋白受體、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、跨膜蛋白等相結(jié)合，通過這種結(jié)合改變Chol-CpG ODN在組織中的轉(zhuǎn)運與分布。進而，可將Chol-CpG ODN納米級顆粒強有力且準確地運送至靶細胞，同時，借助pDCs與吞噬細胞的吞噬或內(nèi)吞作用提高對其的攝取率。除此之外，與膽固醇結(jié)合形成的納米級CpG ODN增加了其自身的免疫刺激活性。因此，借助納米級顆?？捎行岣逤pG ODN的免疫效價。

CpG ODN 與遞呈載體聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢：(1)保護其不被內(nèi)核酸酶快速降解；(2)延長其在體內(nèi)的停留時間；(3)提高細胞對其的攝取率，間接使其應(yīng)用劑量減少，降低可能產(chǎn)生的毒副作用；(4)可準確地將其運送至靶器官；(5)形成緩釋作用，即通過緩慢釋放CpG ODN，延長其在體內(nèi)作用時間；(6)保證其與抗原被同一靶細胞同時攝取，提高免疫刺激活性。鑒于CpG ODN與遞呈載體聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢，對遞呈載體的研究仍然不斷在發(fā)展與完善，開發(fā)出更適合CpG OND臨床應(yīng)用的遞呈載體系統(tǒng)，對提高CpG OND免疫刺激活性和增加機體免疫效應(yīng)，從而使機體更快產(chǎn)生抗體具有深遠意義。

3 小 結(jié)

綜上所述，由于CpG ODN通過激活TLR9誘導(dǎo)產(chǎn)生天然免疫和獲得性免疫，因此其在感染性疾病、過敏性疾病、癌癥的治療中有廣泛的應(yīng)用前景。在改良骨架方面，對于PO-ODN的研究遠不及PS-ODN，但是從提高和保持系統(tǒng)免疫活性的角度觀察，PO-ODN較PS-ODN更有優(yōu)勢。對于遞呈系統(tǒng)的構(gòu)建，隨著材料學(xué)的不斷發(fā)展，CpG ODN遞呈系統(tǒng)會有更大的改善與提高，在保證安全性的前提下，CpG ODN免疫效價會有更顯著地提高。

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