哺乳動物防御素生物學(xué)研究進(jìn)展

盧 順，向 敏，高其雙，黃海軍，陳志華，周 莉，彭 霞，占才耀，夏 瑜，陶弼菲，華 娟，童偉文，王蓮芳

（1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430070）

動物防御素是一類內(nèi)源性陽離子短肽，廣泛分布于包括人類在內(nèi)的各種哺乳動物體內(nèi)，具有廣譜抗菌活性，又被稱為抗菌肽(AMPS)。早在1963年，美國科學(xué)家Zeya等人在研究豚鼠白細(xì)胞裂解物時就發(fā)現(xiàn)該類具有抗菌活性的物質(zhì)[1]。隨后，人們在昆蟲、鳥類、魚類、兩棲類、爬行類和哺乳類等動物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有防御素的存在。到目前為止，已從多種動物和人體內(nèi)分離出百余種防御素。哺乳動物防御素的抗微生物機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥性，是機(jī)體抵抗外來致病性微生物侵襲的重要武器。除了對細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、螺旋體和披膜病毒有毒殺作用外,哺乳動物防御素還對某些惡性腫瘤細(xì)胞有殺傷作用[2]，因此在新藥研發(fā)方面具有較高的開發(fā)價值和良好的應(yīng)用前景。近些年，國內(nèi)外關(guān)于哺乳動物防御素的研究不斷深入，并發(fā)現(xiàn)了一些新的生物學(xué)活性，對其作用機(jī)理也有了更準(zhǔn)確的認(rèn)識，下面對其研究進(jìn)展作一概述。

1 哺乳動物防御素的種類及分布

根據(jù)氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)的不同，哺乳動物防御素可以分為三大類：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。α-防御素最早是在兔的肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后在兔、鼠、豚鼠、短尾猿、人等多種哺乳動物的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、小腸潘氏細(xì)胞（Paneth cell）中都有發(fā)現(xiàn)[3]，在哺乳動物的泌尿生殖道的上皮細(xì)胞、兔的腎臟內(nèi)也有表達(dá)。β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，在哺乳動物多種器官的上皮細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，例如牛、羊、豬、駱駝、馴鹿等動物的胃腸道、呼吸道、生殖道和舌，小鼠及大鼠的腎和肺，人的胃、氣管、皮膚及其他黏膜上皮，以及牛的骨髓等[4]。在某些非上皮組織中，例如心臟、骨骼肌等，也有β-防御素的表達(dá)。θ-防御素發(fā)現(xiàn)較晚，存在于獼猴和狒狒的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，該防御素只在骨髓中有表達(dá)[5]。人和其他哺乳動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)有θ-防御素的表達(dá)。

2 哺乳動物防御素的分子結(jié)構(gòu)特征

成熟的α-防御素是由29～36個氨基酸殘基組成，因富含精氨酸而顯堿性，分子內(nèi)含有6個保守的半胱氨酸形成3對二硫鍵。核磁共振研究證實(shí)，α-防御素3對二硫鍵的連接位置分別為Cysl-Cys6，Cys2-Cys4，Cys3-Cys5，其中Cysl與Cys6的二硫鍵又分別連接N端和C端的半胱氨酸形成分子大環(huán)[6]。成熟的β-防御素由38～42個氨基酸殘基組成，分子結(jié)構(gòu)中也含有6個保守的半胱氨酸殘基，但半胱氨酸的位置及相互連接形成二硫鍵的方式與α-防御素不同。β-防御素分子中二硫鍵連接方式為Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6[7]。θ-防御素是一種成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型防御素，最先由Trabi等通過反向高效液相色譜技術(shù)(RP-HPLC)從獼猴的白細(xì)胞中分離得到[8]，其成熟肽由18個氨基酸殘基組成，也含有3對二硫鍵。二硫鍵對維持防御素的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性起著重要作用。Yoshitha等（2011）發(fā)現(xiàn)，去掉1個二硫鍵后人α-防御素5對金黃色葡萄球菌的殺滅效果明顯減弱，穩(wěn)定性也隨之下降[9]。Himanshu等（2012）在研究二硫鍵與人β-防御素4的活性時也得到了類似的結(jié)果[10]。

3 哺乳動物防御素的生物學(xué)活性

3.1 抗菌與抗病毒活性 哺乳動物防御素具有廣譜的抗菌活性。無論是天然的還是某些人工合成的防御素，均表現(xiàn)出較好的廣譜抗菌性能，對革蘭陽性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體和真菌等具有殺滅或抑制作用，對某些披膜病毒如流感病毒、皰疹病毒和艾滋病病毒(HIV)等，也有很強(qiáng)的殺傷活性或抑制作用。人β-防御素3對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌等革蘭陽性致病菌，銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和放線菌等革蘭陰性菌具有較強(qiáng)的殺傷作用[11]。人工合成的豬β-防御素在體外能夠有效抑制大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌等[12]。從人體分離的多種防御素，例如α-防御素1～3等，均顯示出抑制HIV-1復(fù)制的活性，但作用機(jī)理有所不同[13]。θ-防御素也具有抗菌和抗病毒作用，并且能在鹽離子濃度較高的環(huán)境中保持活性[8，14]。

3.2 抗腫瘤及細(xì)胞毒性作用 哺乳動物的某些防御素能溶解腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除了抗腫瘤細(xì)胞以外，也有報道稱有的防御素對培養(yǎng)的哺乳動物體細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。防御素的細(xì)胞毒效應(yīng)機(jī)理和抗腫瘤選擇機(jī)理尚不十分清楚，一般認(rèn)為是通過破壞癌細(xì)胞膜造成內(nèi)容物外泄、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和DNA受損起作用，也有人認(rèn)為與防御素的細(xì)胞毒性作用和刺激免疫因子產(chǎn)生等有關(guān)。體外試驗(yàn)表明，人α-防御素1能誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞、口腔鱗狀上皮癌細(xì)胞的溶解；人β-防御素1能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[15]，對膀胱癌T24細(xì)胞也具有明顯的體外抑制作用[16]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)作用 哺乳動物防御素除了能直接殺死病原微生物外，也能在體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。人β-防御素2能通過CCR6受體吸引T細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集至炎癥部位（趨化作用），誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫；人α-防御素1和α-防御素2可作為嗜中性粒細(xì)胞的趨化信號，還可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺[17]。鼠β-防御素2能趨化未成熟的樹突狀細(xì)胞，并能刺激IL-12和IFN-γ產(chǎn)生[18]。防御素的免疫調(diào)節(jié)作用對于機(jī)體的非特異性免疫非常重要，有助于提高機(jī)體的抗感染能力。有研究表明，β-防御素2表達(dá)水平較低的人群容易患慢性牙周炎[19]；血漿β-防御素3水平降低的骨折患者手術(shù)部位容易感染[20]。但并非所有的免疫調(diào)節(jié)作用都對機(jī)體有利，最近有研究表明，β-防御素的趨化作用也可促進(jìn)某些腫瘤的生長[21]。

3.4 炎癥反應(yīng)和組織損傷修復(fù) 某些哺乳動物防御素能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的有絲分裂及炎癥部位的組織修復(fù)。人防御素對單核細(xì)胞具有強(qiáng)效趨化作用，在炎癥反應(yīng)中作為嗜中性粒細(xì)胞的趨化信號，誘導(dǎo)單核細(xì)胞在病變部位聚集。在機(jī)體受到病原感染出現(xiàn)炎癥時，某些種類的防御素表達(dá)上調(diào)，有助于機(jī)體對病原微生物的抵抗和殺滅。研究表明，用細(xì)菌的脂多糖刺激小鼠乳腺誘發(fā)乳腺炎，可導(dǎo)致小鼠乳腺中β-防御素1基因表達(dá)量增加[22]。人下呼吸道感染時，外周血β-防御素2水平顯著上升[23]。

4 哺乳動物防御素的抗微生物機(jī)理

對于防御素抗菌活性的機(jī)制，大部分研究認(rèn)為主要與防御素破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。通常認(rèn)為，防御素發(fā)揮抗菌作用可分為3個階段：(1)通過靜電吸引，防御素與靶細(xì)胞膜結(jié)合。防御素帶正電荷，可通過靜電作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜脂層結(jié)合；(2)在膜脂上形成通道。帶正電荷的防御素分子或其多聚體與細(xì)菌質(zhì)膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用，顯著地增加生物膜的通透性。人工脂質(zhì)膜試驗(yàn)顯示，防御素能在膜上形成穩(wěn)定的通道；(3)細(xì)菌內(nèi)容物外泄。通道形成后，靶細(xì)胞的重要物質(zhì)(如鹽離子和大分子)滲出，致使靶細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷而死亡。大多數(shù)真菌、支原體、螺旋體等致病微生物的細(xì)胞膜也和細(xì)菌一樣帶有豐富的負(fù)電荷，所以也是防御素的攻擊對象，而高等動物的細(xì)胞則由于細(xì)胞膜中負(fù)電荷含量較低而免受攻擊。

近年來，隨著研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了防御素的一些新的抗菌機(jī)理。Vera等人在研究人β-防御素3對金黃色葡萄球菌的作用時發(fā)現(xiàn)，人β-防御素3在接近最小抑菌濃度時，并沒有直接導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜穿孔和內(nèi)容物外泄，而是通過與lipidⅡ結(jié)合抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，導(dǎo)致細(xì)胞局部受損，進(jìn)而引起整個菌體崩解[24]。越來越多的證據(jù)表明，防御素可通過多種途徑起到抗菌作用，不僅僅是破壞質(zhì)膜雙分子層[25]。

哺乳動物防御素能殺滅或抑制一些披膜病毒和無包膜病毒，如皰疹病毒、艾滋病病毒、流感病毒和人乳頭瘤病毒等[26]，目前已證明防御素可以3種不同的機(jī)制起到抗病毒的作用。第一種是通過直接與病毒粒子結(jié)合而起作用，例如防御素與包膜病毒結(jié)合，直接破壞病毒脂質(zhì)包膜；第二種是抑制病毒的增殖，例如人α-防御素和β-防御素3能抑制靶細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，從而達(dá)到抑制流感病毒基因復(fù)制及蛋白合成的目的；第三種是阻斷病毒的侵染過程，例如人β-防御素2和β-防御素3能下調(diào)HIV病毒受體CXCR4的表達(dá)，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。許多哺乳動物防御素，如人α-防御素1～3、兔α-防御素2、人β-防御素3、鼠α-防御素1等已被驗(yàn)證能通過不同途徑抑制病毒復(fù)制[27]。

5 哺乳動物防御素的應(yīng)用前景

5.1 新型抗菌藥物 哺乳動物防御素作為一種新型的抗菌肽，主要作用于病原菌的細(xì)胞膜，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性，有望取代部分抗菌藥物在臨床上使用。傳統(tǒng)的抗菌藥物大多作用于病原菌的酶系統(tǒng)，而酶基因的突變或代謝途徑的改變易使病原菌對其產(chǎn)生耐藥性。此外，抗菌藥物殘留也限制了常規(guī)抗菌藥物在生產(chǎn)中的使用，比如鮮奶、豬肉的藥物殘留問題。如果能開發(fā)出用于殺滅病原菌的防御素藥物產(chǎn)品，則能避免上述問題。目前國內(nèi)市場上已有一些防御素產(chǎn)品銷售，可用來提高生豬等的養(yǎng)殖效率。

5.2 新型抗腫瘤藥物 已證明哺乳動物防御素可殺傷多種腫瘤細(xì)胞，如果能建立靶向性的防御素基因治療方法，則可為腫瘤的防治提供新的途徑。例如，將防御素與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)，可定向殺傷腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)的治療腫瘤的方法是放療和化療，這兩種方法對機(jī)體的副作用較大，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也殺傷或毒害正常細(xì)胞。防御素可直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過免疫途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，對機(jī)體正常細(xì)胞損害較小，因此在腫瘤治療中更具優(yōu)勢。關(guān)于防御素抗腫瘤的研究多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚未見到抗腫瘤的防御素藥品推出。

5.3 抗病育種 哺乳動物防御素在抗病育種中的應(yīng)用較少，主要是培育高效表達(dá)防御素的抗病新品種。周春江等（2003）將兔防御素NP-1基因轉(zhuǎn)入到小麥中，得到具有抗白粉病、葉銹病和條銹病新植株[28]；2009年11月27日，人民日報報道我國著名胚胎工程專家、西北農(nóng)林科技大學(xué)教授張涌歷培育出轉(zhuǎn)人防御素的基因克隆奶牛。這是世界首例轉(zhuǎn)人防御素的基因克隆奶牛，它的誕生可能會對我國畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生較深的影響。

6 結(jié)束語

雖然哺乳動物防御素在抗菌、抗病毒等方面顯示出了無限的潛力，但是在臨床應(yīng)用上還存在一些問題，例如天然含量較少，分離純化困難，人工合成成本高，臨床應(yīng)用的安全性等，這些都是有待解決的問題。隨著研究的深入與人工合成技術(shù)的進(jìn)步，人們對哺乳動物防御素的認(rèn)識將越來越清楚，開發(fā)防御素制品的能力也會越來越強(qiáng)。目前，一些β-防御素類藥品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有望作為替代品用于治療細(xì)菌和病毒感染等。相信在不久的將來，防御素類藥物就能廣泛應(yīng)用于疾病防治、科學(xué)研究和基因治療等領(lǐng)域。

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