血清Th17和Treg細(xì)胞在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及作用機(jī)制

張秀英 董硯奉 董漢玉

(淄博市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，山東 淄博 255000)

銀屑病性關(guān)節(jié)炎不僅損害關(guān)節(jié)導(dǎo)致殘疾，更有皮膚損害的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量〔1〕。銀屑病性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，有學(xué)者認(rèn)為其與遺傳、內(nèi)分泌障礙、代謝障礙及免疫功能損傷等有關(guān)〔2〕。已有研究證實(shí)，銀屑病的發(fā)病與效應(yīng)CD4+T細(xì)胞有關(guān)。輔助性T細(xì)胞(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)分別是CD4+T細(xì)胞的新型亞群，有多種關(guān)節(jié)炎性疾病及自身免疫性疾病與這兩種細(xì)胞比例失衡有關(guān)〔3，4〕。本研究探討其在銀屑病性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2012年2月至2014年2月于我院風(fēng)濕免疫科就診的70例銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者，其中男36例，女34例，平均年齡(65.2±1.6)歲，病程0.5～18年。所以患者均符合以下入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為銀屑病性關(guān)節(jié)炎；(2)近2 w內(nèi)接受過(guò)糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等相關(guān)藥物治療；(3)不合并心腦血管、肝、腎、內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)性疾??；(4)患者知情同意。對(duì)照組30例均來(lái)自門(mén)診健康體檢者，其中男16人，女14人，平均年齡(64.8±1.6)歲，均無(wú)風(fēng)濕病及其他自身免疫性疾病病史。試驗(yàn)組與對(duì)照組的性別構(gòu)成及年齡分布的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，資料均衡可比。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1IL-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。主要操作步驟按照ELISA試劑盒(Biosource，美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2Th17細(xì)胞亞群檢測(cè) 采集肝素鈉抗凝全血進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)的方法為：RPMI1640培養(yǎng)液按1∶1的比例稀釋后加入終濃度為50 g/L的PMA、終濃度為1 mg/L的離子霉素及1 ml/L的莫能霉，混勻后在溫度為37℃，CO2濃度為50 ml/L培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。取50 μl培養(yǎng)后的全血，加入10 μl的PerCp-抗CD3mAb和10 μl的(FITC)-抗CD4mAb，4℃避光孵育30 min后，加入溶血?jiǎng)㎞H4Cl 2 ml后離心棄上清液，加入10 ml的Fixation/ Permeabilization穿膜45 min。加入10 μl的PE-抗人白細(xì)胞介素(IL)-17A mAb抗體，同型對(duì)照加入10 μl的PE-鼠IgG。4℃避光孵育30 min后對(duì)IL-17A進(jìn)行染色，用FACSCanto檢測(cè)固定后的標(biāo)本，并采用BDFACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果以CD4+IL-17+T細(xì)胞在CD3+CD4+T細(xì)胞中的比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群檢測(cè) 取50 μl未經(jīng)刺激培養(yǎng)的肝素鈉抗凝全血加入10 μl的FITC-抗CD4/(APC)-抗CD25二聯(lián)抗體，4℃避光孵育30 min后用以標(biāo)記CD4+CD25+T細(xì)胞，使用1 ml的Fixation/Permeabilization穿膜45 min。加入10 μl正常鼠血清，4℃封閉15 min加入10 μl的PE-抗人Foxp3mAb，同型對(duì)照加入10 μl的PE-鼠IgG2b，4℃孵育30 min后進(jìn)行染色，用300 μl染色緩沖液重懸，用FACSCanto檢測(cè)固定后的標(biāo)本，并采用BDFACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。以Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞在CD3+CD4+T細(xì)胞中的比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件分析t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組IL-17和TGF-β1水平的比較 試驗(yàn)組IL-17水平〔(423.57±156.0)ng/L〕高于對(duì)照組〔(253.50±131.45)ng/L〕(P<0.05),TGF-β1水平〔(177.34±97.13)ng/L〕低于對(duì)照組〔(233.95±116.15)ng/L〕(P<0.05)。

2.3兩組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量的比較 試驗(yàn)組Th17細(xì)胞數(shù)量〔(15.58±1.54)%〕、Th17/Treg比值(2.89±0.43)均高于對(duì)照組〔(8.44±1.33)%,(1.71±0.15),P<0.05〕,Treg細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相近〔(6.13±1.42)% vs (5.85±1.16)%,P>0.05〕。

3 討 論

銀屑病性關(guān)節(jié)炎是一種主要累及韌帶、肌腱、筋膜和關(guān)節(jié)的自身免疫性炎癥性疾病，其發(fā)病率雖然較低，但是嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及生存時(shí)間，給患者及社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。CD4+T細(xì)胞的數(shù)量及功能狀態(tài)與自身免疫性疾病有密切關(guān)系，CD4+T細(xì)胞有許多亞型如Th1、Th2等，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)新亞型，主要用于維持機(jī)體正常免疫應(yīng)答防止自身免疫性疾病的產(chǎn)生，是與Th1、Th2功能完全不同的亞型，已有許多研究者發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

IL-17是Th17細(xì)胞作為一種效應(yīng)T細(xì)胞所分泌的，銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者這兩者水平均高于正常人，本文結(jié)果與已有研究結(jié)果相近〔1,5〕。提示Th17細(xì)胞的高水平表達(dá)促使 IL-17分泌增加， IL-17刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2繼而刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生破骨細(xì)胞分化因子，激活核因子-κB，破骨細(xì)胞分化因子與破骨細(xì)胞前體上的核因子-κB結(jié)合，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的形成與活化〔6〕。且Th17本身表達(dá)破骨細(xì)胞分化因子與破骨細(xì)胞前體上的核因子-κB結(jié)合，從而參與銀屑病性關(guān)節(jié)炎癥病變及骨質(zhì)破壞的過(guò)程。本發(fā)現(xiàn)TGF-β1可能參與了銀屑病性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病， TGF-β1是調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞分化增殖的內(nèi)分泌生長(zhǎng)因子，與骨組織的形成及修復(fù)等關(guān)系密切，因此其含量降低易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，Treg細(xì)胞通過(guò)抑制性細(xì)胞因子TGF-β1水平發(fā)揮主動(dòng)免疫抑制作用〔7～9〕，提示Treg細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1水平從而與銀屑病性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程有關(guān)。

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