飼料中二惡英檢測方法研究進展

李曉敏， 張慶華， 王 璞

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京海淀 100081；2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京海淀100085）

二惡英是多氯代二苯并-對-二惡英（PCDDs）和多氯代二苯并呋喃（PCDFs）兩大類化合物的統(tǒng)稱，是第一批被列入《斯德哥爾摩公約》的12種典型持久性有機污染物（POPs）中的兩類，因具有強致癌性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性和生物蓄積性而備受關(guān)注（Johnson，1995）。

二惡英是工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要來源于含氯化學品制造、市政垃圾焚燒、三廢排放以及廢舊電子垃圾拆解焚燒過程 （鄭明輝等，1999），其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解，能通過各種途徑進入食物鏈。由于二惡英毒性大，易在動物體內(nèi)蓄積的特性，其在低濃度下也易對人類和動物產(chǎn)生健康影響，因此，在痕量水平上分析二惡英成為研究飼料中該類化合物的基礎(chǔ)。

1 飼料中二惡英的分析方法及限量標準

二惡英前處理效果直接影響檢測結(jié)果的靈敏度和準確性（Malavia等，2007）。如何從不同基質(zhì)中分離二惡英并對其進行準確定性定量分析是開展該類化合物研究的基礎(chǔ)。上世紀70年代末，基于同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜（isotope dilution-HRGC/HRMS）的二惡英分析方法已趨于成熟，在測定一些痕量及超痕量濃度水平樣品時，該方法是目前唯一具有法律效力的檢測方法。我國正在運行的二惡英檢測實驗室大多采用歐美和日本等國家機構(gòu)頒布的標準方法對二惡英進行分析檢測，如USEPA 1613b被廣泛用于檢測環(huán)境、食品樣品中痕量二惡英 （EPA，1994a），EN 1948用于檢測飛灰中二惡英 （EN-1948-1，2，3：2006），USEPA 8290 用于檢測固體廢棄物中二惡英等（EPA，1994b）。

目前，我國也已制定基于同位素稀釋-HRGC/HRMS的飼料中二惡英類化合物的檢測方法，該方法涵蓋眾多飼料產(chǎn)品：包括飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑預(yù)混合飼料以及飼料添加劑等，已于2012年11月1日正式開始實施（GB/T 28643-2012）。

盡管目前對飼料中二惡英類化合物的檢測方法仍以HRGC/HRMS方法為確證方法和主要方法，但在大量篩選樣品時，為降低分析成本，一些實驗室也采用生物方法進行初步判定。本文中介紹的前處理技術(shù)和檢測方法也適用于多種基質(zhì)，包括飼料、食品、環(huán)境基質(zhì)、生物樣品等。

1.1 二惡英前處理技術(shù) 二惡英分析難點在于其含量低（可達fg/g水平）、易受基質(zhì)效應(yīng)干擾，而飼料和生物組織基質(zhì)復(fù)雜，干擾物眾多，并且這些干擾物水平一般遠高于目標化合物。在二惡英實際分析檢測工作中常出現(xiàn)檢測限高、回收率低的情況。此外，由于目前國際通用的HRGC/HRMS法中，高分辨質(zhì)譜極易受到高濃度樣品污染，因此，為得到更低的樣品檢出限，避免儀器污染和其他雜質(zhì)干擾，二惡英的前處理過程要求極為嚴格。

索氏提取法是較為經(jīng)典的持久性有機污染物提取方法，目前許多二惡英實驗室仍然采用這種方法對樣品進行萃取。隨著前處理技術(shù)發(fā)展，其他新型樣品提取方法，如加壓液體萃取法（PLE）和微波輔助萃取法（MAE）等開始被廣泛應(yīng)用于多種樣品基質(zhì)的提取中 （Rawa-Adkonis等，2003）。

利用色譜填料法對樣品進行預(yù)處理是常見的樣品前處理凈化技術(shù)。常見的二惡英前處理凈化填料有：氧化鋁、活性炭、硅膠、弗羅里土以及部分填料的變性材料等。USEPA 1613b方法對液體和固體樣品、多重復(fù)雜基質(zhì)樣品和組織樣品的前處理建立了詳細流程，但同時指出，在保證質(zhì)量的基礎(chǔ)上，各實驗室可對該方法進行改進或優(yōu)化。此外，凝膠滲透色譜（GPC）經(jīng)常被用于分離樣品基質(zhì)中的脂肪和大分子共流出干擾物（Zacs等，2013；Rossetti等，2012）；在一些復(fù)雜基質(zhì)中，當2，3，7，8-位取代的同系物被干擾或者樣品中存在難以通過色譜法去除的雜質(zhì)時，通常采用HPLC（high-performance liquid chromatography）對樣品進行進一步分離 （Engwall等，1997；EPA，1994a）；C18/硅膠填料的SPE柱可用于對生物基質(zhì)樣品的快速前處理凈化（Chang等，1990）。除常見色譜填料外，濃硫酸常被用于去除提取物中的脂肪和其他有機干擾物，銅粉通常被用于去除提取物中的硫。

目前國際上已有全自動二惡英前處理設(shè)備。FMS公司開發(fā)的 fluid management systems（FMS）全自動凈化系統(tǒng)，通過三根成品凈化柱（硅膠柱、氧化鋁柱和碳柱）的凈化，實現(xiàn)二惡英類化合物（二惡英和多氯聯(lián)苯）的分離，處理后的樣品經(jīng)濃縮后可直接進行HRGC/HRMS測定。該方法性能穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，滿足USEPA 1613b標準的要求。同時，F(xiàn)MS前處理技術(shù)可大幅提高分析速度，使分析周期大大縮短。但這種方法存在儀器和耗材昂貴的缺點，而且受通道數(shù)量限制，一次性處理樣品數(shù)量有限。

1.2 儀器檢測方法

1.2.1 HRGC/HRMS 利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）測定多種基質(zhì)中的二惡英是分析這類化合物常見的方法（Katami等，2002；Roy 等，2002）?；跉庀嗌V的分離能力和質(zhì)譜對特定離子的選擇性，GC/MS方法要優(yōu)于早期使用的其他方法（如GC/ECD、紅外等）。但是，環(huán)境樣品中毒性最強的二惡英單體 2，3，7，8-TCDD， 含量水平為ppt甚至ppq級別，受檢測限限制，GC/MS仍然無法對其定性定量。Baughman和Meselson（1973）優(yōu)化了二惡英前處理方法，利用HRMS對2，3，7，8-TCDD 進行檢測，將檢測限降到 1.0 ppt的水平。此后，同位素稀釋-HRGC/HRMS方法被廣泛應(yīng)用于對環(huán)境樣品（土壤、空氣、水、底泥）、生物樣品（組織、內(nèi)臟、血液、胎盤、乳液）和食品中二惡英類化合物的檢測（Hernandez等，2012），同時，該方法也被公認為二惡英檢測的“黃金法則”。我國國標中對飼料中二惡英類化合物檢測方法即采用此方法。

雖然HRGC/HRMS法可以實現(xiàn)二惡英單體的定性定量檢測，但HRGC/HRMS法仍然存在一些缺點：如該方法的樣品前處理過程復(fù)雜，檢測周期長，對分析儀器、實驗室環(huán)境和操作人員的要求較高，分析成本極為昂貴等。此外，由于二惡英化合物單體眾多，且單體間物理化學性質(zhì)極為相近，因此很難在一根色譜柱上實現(xiàn)所有單體的分離；與二惡英性質(zhì)相近的多氯聯(lián)苯（PCBs）、芳香烴類化合物也會對二惡英分析造成干擾。一般解決方法是先后利用多根不同性質(zhì)的色譜柱重復(fù)進樣，多次進行分析（EPA，1994a）。 一些常見的色譜柱，如 DB-5ms（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷）、DB-Dioxin（44%甲基-28%苯基-20%氰丙基聚氧硅烷-8%聚乙二醇）、SP 2331（100%氰丙基聚氧硅烷）以及與其涂層類似的色譜柱都可被用于分離二惡英不同單體（Eljarrat和 Barcelo，2002）。

1.2.2 其他儀器檢測方法 為解決單根色譜柱分離二惡英共流出的現(xiàn)象，科研人員嘗試利用具有高靈敏度的全二維氣相色譜技術(shù)（GC×GC）分離檢測二惡英類化合物 （Eljarrat和 Barcelo，2002）。GC×GC法能獲得較窄的色譜峰譜圖，該方法可提高柱效，減少分析時間，改善結(jié)構(gòu)相似污染物色譜峰的分離度，提高污染物監(jiān)測的準確性。同時，多種色譜柱交叉使用可避免復(fù)雜的色譜柱更換、重復(fù)進樣操作 （Focant等，2004；Kemmochi等，2003）。因 GC×GC 系統(tǒng)需要配備快速檢測器，因而一般與TOF/MS、ECD、MS等檢測器連接（Eljarrat和 Barcelo，2002）。其中利用 GC×GC-TOF/MS系統(tǒng)對二惡英進行檢測已有眾多研究報道（Hoh 等，2008；Focant等，2005）。GC×GCTOF/MS的分辨率可達5000～7000，雖然低于HRMS，但可同時進行全掃描和選擇離子掃描檢測。雖然目前利用這種方法對二惡英檢測還比較少見，但其操作簡便，仍具有一定應(yīng)用前景。受掃描速度限制，HRMS一般難與GC×GC匹配。但在最近一項研究中，Patterson等（2011）將GC×GC與高分辨質(zhì)譜搭載對人體血清中二惡英進行分析，對HRMS參數(shù)進行優(yōu)化，在保證儀器靈敏度的前提下減少質(zhì)譜掃描時間，可得到血清樣品中 1，2，3，7，8-PeCDD 單體（223 ag）的信噪比為 188∶1。

氣相色譜-三重四級串聯(lián)質(zhì)譜法 （GC-MS/MS）也常被用于對二惡英類化合物的檢測。由于該方法對前處理要求低于傳統(tǒng)的HRGC/HRMS法，且具有優(yōu)異的選擇性和靈敏度，因此應(yīng)用也較為廣泛，尤其適用于一些含量較高的樣品（Cunliffe 和 Williams，2006；Eppe 等，2004；Tondeu 等，1987）。 Malavia等（2007）利用 GC-MS/MS 測定植物油中的PCDD/Fs和PCBs，結(jié)果顯示二惡英檢測限可達到0.04～0.20 pg/g。但GC-MS/MS的檢測限受基質(zhì)干擾較大，當被用于測定土壤中PXDD/PXDFs（X=Br，Cl）時，檢測限（3.8 ～ 44 pg/g）遠高于 HRGC/HRMS的結(jié)果 （Myers等，2012）。GC-MS/MS與HRGC/HRMS方法相比較，具有更好的選擇性，但其靈敏度要低于后者。

1.3 生物/免疫檢測方法 傳統(tǒng)儀器檢測方法準確可靠，但前處理過程復(fù)雜、消耗大量化學試劑和耗材，分析成本高、周期長，無法同時處理大量樣品。生物/免疫檢測方法（Bioassay/Immunoassay methods）是針對傳統(tǒng)儀器分析方法的缺點而發(fā)展起來的二惡英檢測技術(shù)。Nebert（1972）提出二惡英類物質(zhì)受體致毒機制以來，基于2，3，7，8位取代的二惡英單體與芳香烴受體（AhR）特異性結(jié)合的毒理學研究以及檢測方法開發(fā)一直是該領(lǐng)域的研究熱點。其原理是利用與二惡英具有特異性結(jié)合位點的抗體、受體、酶，借助其對二惡英化合物的識別能力，通過測定生物分子活化程度，從而間接確定二惡英毒性當量。生物/免疫檢測方法的優(yōu)點是檢測時間短、操作簡單、價格低廉，與同位素稀釋/高分辨方法相比可將分析成本降低50%以上 （Reiner等，2006）。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，美國EPA已將幾種生物檢測方法推薦為指導(dǎo)方法。歐盟也將細胞的生物檢測法（cel1-base bioassay）和利用試劑盒的生物檢測法（kit-base bioassay）作為二惡英篩選方法（European Commission，2002a）。 生物法測試周期短，可平行測試大量樣品，適于快速、大規(guī)模樣品的篩選，缺點是只能測定總毒性當量（Behnisch等，2001a）。目前常見的二惡英生物檢測方法包括：EROD酶 （7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶）活力誘導(dǎo)法、熒光素酶報告基因法（CALUX）、酶免疫分析法（EIA）、熒光免疫分析法（DELFIA）等（Behnisch 等，2001b）。

EROD酶與二惡英結(jié)合存在良好的時間-效應(yīng)關(guān)系。當AhR與TCDD構(gòu)成的復(fù)合體進入細胞核后，可與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白再度結(jié)合并識別特定DNA片段，與之結(jié)合后可啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，激活EROD酶的活性。因此通過測定EROD酶活性可間接獲得TCDD與AhR結(jié)合水平。研究表明，在一定范圍內(nèi)，EROD酶活與二惡英濃度呈線性關(guān)系。與免疫方法和熒光素酶方法相比，EROD法在測定CYP1A1基因催化活性時，結(jié)果更接近動物體內(nèi)真實反應(yīng)。作為較早開發(fā)的二惡英生物檢測法，EROD應(yīng)用較為廣泛，如曾被用于研究雌雄魚體肝臟組織中化合物二惡英暴露差異（balos等，2010），以及大鼠肝臟和脂肪組織中二惡英時間劑量代謝關(guān)系（ábraham等，1988）。Schoffer等（2011）用 EROD（H4IIE 細胞株）法和HRGC/HRMS法測定雞肉中二惡英，并用回歸模型對其進行校正，結(jié)果顯示該方法可被用于篩選動物產(chǎn)品中二惡英超標樣品。但使用EROD方法易造成假陰性結(jié)果，其測定線性范圍也較CALUX略窄（Behnisch 等，2001a）。

CALUX方法是目前發(fā)展較快的二惡英快速測定方法。與EROD方法相比，CALUX方法具有更高的靈敏度，且其檢測的線性范圍更寬，所需時間更短，目前已廣泛用于對多種環(huán)境介質(zhì)、生物樣品和食品中二惡英的檢測，適合大量樣本的快速篩選。由于CALUX法是特異性測定樣品中所有具有AhR受體的化合物，所以其受到的干擾較儀器分析法更為復(fù)雜，樣品提取、凈化以及樣品基質(zhì)均會給分析帶來較大影響，一般CALUX得出的結(jié)果會高于儀器分析結(jié)果 （Windal等，2005）。 周志廣等（2001）利用 CALUX 法測定廢氣中二惡英類化合物，并用HRGC/HRMS方法對分析結(jié)果進行校正，結(jié)果顯示兩種方法得出的數(shù)值相差較大，但是兩種方法相關(guān)性良好（R2=0.9948）。

EIA法通過將特異性抗體與二惡英結(jié)合，將化合物固定在EIA管壁上，利用競爭酶與樣品中二惡英共同競爭抗體的特異性結(jié)合位點的原理，以不同濃度二惡英為標準物質(zhì)制作標準曲線，最終通過測定抗體與競爭酶的熒光強度反向推算二惡英濃度水平。該方法操作簡便，價格低廉，可平行測定多個樣品，有商品化的試劑盒，便于采集樣品后在現(xiàn)場迅速完成測定。但該方法開發(fā)費用昂貴，非特異性干擾較多，無法獲得化合物對生物活性的影響，而且對二惡英和多氯聯(lián)苯需采取不同的EIA方法。

生物/免疫分析法的缺點主要表現(xiàn)在：（1）不能添加回收內(nèi)標，因此無法計算回收率；（2）只能得到總TEQ數(shù)據(jù)，無法確知單體的含量和TEQ值；（3）生物/免疫法屬于半定量方法，可能出現(xiàn)結(jié)果誤判。在處理具有爭議的結(jié)果時，仍須儀器方法進行確證。因此，生物/免疫法一般用于大量樣品的篩選或含量較高的樣品的測定以及無需對單體進行定量的情況。

2 研究前景

我國對二惡英類化合物的研究工作起步較晚，特別是對飼料和農(nóng)產(chǎn)品中二惡英的研究較少，對復(fù)雜飼料基質(zhì)中二惡英的檢測尚需進一步研究。在對飼料中二惡英的檢測方面，短期內(nèi)，仍將以同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀定性定量為主；生物檢測方法因其低成本和高通量的特點，也將會日漸推廣開來。從長遠來看，一些新型儀器，如APGC（atmospheric pressure gas chromatography）-MS/MS等都具有較好的研發(fā)前景，極有可能以其相對低廉的成本和與高分辨磁質(zhì)譜相似的靈敏度與分辨率逐漸在二惡英檢測中得到應(yīng)用。

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