豬尿中鹽酸賽庚啶殘留指示物研究

吳劍平， 張 鑫， 李丹妮， 嚴 鳳， 周悅榕， 顧 欣

（上海市獸藥飼料檢測所，上海長寧 201103）

鹽酸賽庚啶是一種H1受體拮抗藥，在臨床上主治皮膚瘙癢、蕁麻疹、濕疹、過敏性和接觸性皮炎、鼻炎、偏頭痛、支氣管哮喘等疾?。P(guān)保元等，2007；王雷等，2004）。鹽酸賽庚啶用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)可以促進動物生長，其具有抗5-羥色胺的作用，可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲，增加體重。賽庚啶在動物體內(nèi)的殘留可對食用者的健康產(chǎn)生危害。

本試驗通過動物實驗，獲得了實際飼喂含鹽酸賽庚啶飼料的生豬尿液，并利用已建立的分析方法對其進行分析檢測，獲得豬尿中鹽酸賽庚啶原藥的殘留情況。動物體內(nèi)鹽酸賽庚啶的主要代謝途徑為葡萄糖醛酸修飾和芳香基團修飾（Xesús等，2009），因此對尿液進行葡萄糖醛酸酶和硫酸芳基酯酶酶解后進行測定，并通過與尿中原型藥物殘留量的比較得到其主要代謝產(chǎn)物的殘留量情況，從而確定鹽酸賽庚啶在豬尿中的殘留指示物。

1 試驗材料

1.1 儀器 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters○RUPLC-TQ MS，Masslynx○R工作軟件）；高速冷凍離心機 （Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（B-490，BUCHI）。

1.2 材料、藥品與試劑 十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Agilent○R SB-C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；混合型離子交換SPE柱 （Waters○R MCX，60 mg 3cc）。鹽酸賽庚啶標準品（Sigma，Lot：068k1565，98%）；鹽酸二苯拉林標準品（Sigma，Lot：126 h3541，100%）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Merk， 美國，85000 IU/mL）；芳基硫酸酯酶（Merk，美國，7500 IU/mL）。 高氯酸（分析純）；甲酸（色譜純）；乙腈（色譜純，Merk）；甲醇（色譜純，Merk）；氨水（分析純）；去離子水（自制，電阻率>10 MΩ·cm）；高純氮（上海佳杰特種氣體公司，99.999%）；高純氬（上海佳杰特種氣體公司，99.999%）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相A為0.1%甲酸；流動相B為0.1%甲酸-乙腈，優(yōu)化色譜條件后的梯度程序見表1。柱溫為40℃；流速為0.3 mL/min；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件 電離模式：正離子電噴霧電離（ESI＋）；質(zhì)譜檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；脫溶劑溫度：500℃；孔流速：50 L/h；碰撞氣（Ar）流速：0.25 mL/min。分析中以保留時間和離子對豐度比作為定性分析依據(jù)，經(jīng)過實驗優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2，典型MRM圖見圖1b。

表2 監(jiān)測離子對質(zhì)譜參數(shù)

2.3 樣品前處理 取5.00 g豬尿樣品，其中加入 50 μL含 100 μg/L鹽酸二苯拉林的標準工作溶液，用5%氨水調(diào)節(jié)pH至11.0，再以異丙醇為分散劑，三氯甲烷為萃取劑，在5 mL豬尿體系中加入2 mL三氯甲烷-異丙醇 （5∶3，V/V）混合提取液和0.75 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min使其形成水－分散相－提取劑充分混勻的體系。靜置后，4℃下8000 r/min高速離心5 min，吸取下層溶劑至離心管中50℃氮氣吹干后，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（80∶20，V/V）溶解后過濾，上機測定，空白樣品和實際樣品典型MRM圖見圖1a和圖 1c。

圖1 鹽酸賽庚啶及鹽酸二苯拉林MRM圖

2.4 動物實驗 選取15頭100日齡健康生豬，分3組進行飼喂實驗，其中A組為空白對照組，B組為低劑量實驗組，C組為高劑量實驗組，飼喂飼料除添加藥物量不同外其他均相同，一天飼喂兩次，分欄飼養(yǎng)，具體飼喂量如表3所示，一天分早晚兩次進行尿液采集，當天將采集到的尿液進行3000 r/min高速離心，取上清液50 mL存于尿樣管中，4℃保存待測。

表3 實驗動物每頭份飼喂量

2.5 分組給藥實驗結(jié)果 按2.4動物實驗過程進行藥物添加飼喂，采集尿樣按2.1～2.3中檢測方法進行分析測定，結(jié)果如圖2所示。實驗結(jié)果表明，在飼料中添加不同含量的鹽酸賽庚啶對實驗動物進行飼喂后，其尿液中的鹽酸賽庚啶含量比空白對照組有顯著提高，且與飼料中的添加含量呈正相關(guān)。

圖2 分組給藥實驗結(jié)果

2.6 酶解反應(yīng)條件優(yōu)化 使用2.5實驗中所采集第3天B1豬的尿樣進行酶解條件優(yōu)化，5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，根據(jù)試劑說明書描述最優(yōu)酶解pH=5.6，對反應(yīng)溫度進行優(yōu)化。分別在35、45、55、65℃條件下酶解 1、2、4、6、8 h 后對鹽酸賽庚啶含量進行測定，所得如圖3所示。結(jié)果表明，在35℃條件下需要反應(yīng)的時間較長，8 h仍未達到反應(yīng)終點；在45℃和55℃時需要4 h可達到反應(yīng)終點，65℃下只需2 h，但55℃和65℃下達到終點后鹽酸賽庚啶含量有一定的下降趨勢，可能是由于溫度較高容易促使鹽酸賽庚啶原型藥物發(fā)生其他反應(yīng)。因此，實驗結(jié)果表明最優(yōu)酶解條件為5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，55 ℃下酶解4 h。

圖3 酶解溫度優(yōu)化結(jié)果

2.7 非酶解和酶解后尿中鹽酸賽庚啶含量的比較 對2.5中分組飼喂實驗中所采集的尿樣進行酶解，比較酶解后與酶解前所測得的豬尿中的鹽酸賽庚啶含量，結(jié)果如圖4所示。實驗結(jié)果表明，豬尿中鹽酸賽庚啶原型藥物含量占主要代謝物種類中的絕大多數(shù)，可以作為豬尿中檢測鹽酸賽庚啶的殘留指示物。

圖4 非酶解和酶解結(jié)果比較

2.8 停止給藥消除實驗 在2.5分組給藥飼喂實驗結(jié)束后停止在B組和C組飼料中添加藥物，然后，連續(xù)7 d進行采樣，檢測豬尿中鹽酸賽庚啶殘留量，結(jié)果如圖5所示。實驗結(jié)果表明，停止給藥后豬尿中鹽酸賽庚啶原型藥物殘留量有明顯下降趨勢，其中半衰期為2 d，6 d后完全消失。

圖5 停藥消除實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，豬尿中鹽酸賽庚啶主要以原型藥物的形式存在。其含量與飼喂量呈正相關(guān)，半衰期為2 d，6 d后幾乎完全消除。

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