南方鲇飼用嗜酸乳桿菌微囊化研究

許青蓮， 邢亞閣*， 車振明， 蔣 麗， 張麗珠， 蔡義民

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點實驗室，四川成都 610039；2.日本農(nóng)業(yè)科學(xué)國際研究中心，日本筑波 30528686）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）是動物腸道有益微生物之一，可以維持腸道正常菌群的生態(tài)平衡，增強機體免疫力，促進消化，合成氨基酸和維生素等。嗜酸乳桿菌還可阻止病原菌對腸道的入侵和定植，防止多種疾病和不良反應(yīng)的發(fā)生，在機體中發(fā)揮著重要的生理作用。但是，由于嗜酸乳桿菌對環(huán)境因素（氧、水分和高溫）、機械擠壓、熱激以及胃酸等都非常敏感，穩(wěn)定性較差，極大地限制了它的廣泛應(yīng)用（趙瑞香，2007）。

微囊化技術(shù)是用特殊手段將固體、液體、氣體等物質(zhì)包埋在一個微小封閉的膠囊內(nèi)的技術(shù)，改變物質(zhì)的色澤、形狀、耐熱性和儲藏性等（吳曉，2011）。目前，利用微囊化制備技術(shù)保護益生菌是國內(nèi)外研究的熱點之一，它能顯著提高益生菌抗熱、抗壓和抗胃酸能力，使其以活性狀態(tài)到達腸道，發(fā)揮功效。該技術(shù)還能保護益生菌免受噬菌體的侵害，提高其在冷凍干燥過程中的存活，增加貯藏過程中的穩(wěn)定性（張志焱，2012）。

本研究以多孔淀粉、甘油、葡萄糖、甘露醇四種不同物質(zhì)作為保護劑，利用真空冷凍干燥技術(shù)制成微膠囊，研究這四種不同保護劑對制作微生態(tài)制劑的影響，并對其外觀形態(tài)和穩(wěn)定性能等進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料、試劑與儀器 嗜酸乳桿菌，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC 6075）；多孔淀粉由遼寧立達生物科技有限公司提供；甘油由常州市無明化工有限公司提供；葡萄糖由常州市金文化工有限公司提供；甘露醇由鄭州康源化工有限公司提供；Heto lyolab3000型冷凍干燥機 （丹麥Heto公司）；JSM-7500F掃描電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑制備工藝 取樣品菌粉1 g，溶于100 mL 2%葡萄糖溶液（已滅菌）中，37℃靜置活化30 min，然后以無菌方式按5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基（已滅菌）中，搖勻，（37±1）℃恒溫培養(yǎng) 18 h。將離心后的菌體用滅菌后的生理鹽水適當稀釋，調(diào)整活菌濃度至108cfu/mL，以備用。在無菌操作條件下，稱取一定量的保護劑于燒杯中，加入濃度為108cfu/mL菌懸液50 mL，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值為6.0后，在20℃無菌條件下振蕩40 min，至完全吸附，加入2%海藻酸鈉溶液（無菌），攪拌均勻。用膠頭滴管將制作好的保護劑溶液擠入2%的氯化鈣溶液（無菌）中，固化30 min成膜。用3.5%氯化鈣溶液浸泡10 min進行硬化。過濾取得樣品，用清水漂去表面的氯化鈣殘液，再用滅菌的生理鹽水（0.85%）洗滌微膠囊表面菌體。在-40℃的超低溫冰箱中預(yù)凍4 h以上，然后在溫度為-58℃的冷凍干燥機進行冷凍干燥24 h，使其水分含量小于3%，即得嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑，將凍干后的微膠囊進行真空包裝，在4℃冰箱中保藏。

1.2.2 單因素試驗 多孔淀粉用量對包埋率的影響：配制活菌濃度為108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL燒杯中，調(diào)pH為6.0，加入無菌的多孔淀粉作為保護劑，加入量分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，然后按1.2.1所述工藝制備微生態(tài)制劑，分析不同淀粉加入量對包埋率的影響。

葡萄糖用量對包埋率的影響：配制活菌濃度為108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL燒杯中，調(diào)pH為6.0，加入無菌的葡萄糖作為保護劑，加入量分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g， 然后按 1.2.1 所述工藝制備微生態(tài)制劑，分析不同葡萄糖加入量對包埋率的影響。

甘油用量對包埋率的影響：配制活菌濃度為108cfu/mL 50mL的菌液于250 mL燒杯中，調(diào)pH為6.0，加入無菌的甘油作為保護劑，加入量分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 然后按 1.2.1 所述工藝制備微生態(tài)制劑，分析不同的甘油加入量對包埋率的影響。

甘露醇用量對包埋率的影響：配制活菌濃度為108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL燒杯中，調(diào)pH為6.0，加入無菌的甘露醇作為保護劑，加入量分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 然后按 1.2.1 所述工藝制備微生態(tài)制劑，分析不同的甘露醇加入量對包埋率的影響。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇多孔淀粉、葡萄糖、甘油、甘露醇用量4個因素分別設(shè)置了3個水平，并特設(shè)了一個零水平，因素與水平見表1。

表1 因素與水平

1.2.4 包埋率測定 包埋的活菌數(shù)與原始活菌數(shù)的比率即為包埋率。微膠囊包埋效果的測定采用曹永梅等（2002）的方法進行?；罹嫈?shù)依據(jù)GB 4789.35-2010標準進行。

1.2.5 形態(tài)表征 在掃描電鏡樣品臺上貼上雙面膠，均勻粘貼少量微生態(tài)制劑粉末。然后噴金，采用JSM-7500F SEM觀察，電壓為12kV，觀察微生態(tài)制劑的形貌。

1.2.6 貯存穩(wěn)定性分析 將凍干的微生態(tài)制劑分別置于0、4、25、37℃的條件下貯存6周，每隔一周取樣，測定微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)，以此來評價其貯存穩(wěn)定性和最佳貯存溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 多孔淀粉用量對微膠囊化的影響 由圖1可知，隨著多孔淀粉用量的增加，包埋率先增加后降低，當多孔淀粉用量在5 g時，制劑的包埋效果最好。多孔淀粉顆粒的孔洞對嗜酸乳桿菌有一定的容納數(shù)量，即飽和度，當達到該飽和度時，多孔淀粉添加量的增加不會引起包埋率的增加。另外當多孔淀粉用量較低或較高時，會使制成的微囊粒徑過小或過大，造成微膠囊的收集困難，使包埋率降低。因此，添加多孔淀粉作單一保護劑時，選擇4 g較適宜。

圖1 多孔淀粉用量對微膠囊化的影響

2.1.2 葡萄糖用量對微膠囊化的影響 由圖2可知，隨著葡萄糖用量的增加，包埋率先增加后降低。當葡萄糖用量為5 g時，此時的包埋率最高，為52.5%，當葡萄糖的用量增加時，包埋率隨著用量的增加而降低。因此，單一添加葡萄糖作為保護劑時，選擇4 g較適宜。

圖2 葡萄糖用量對微膠囊化的影響

2.1.3 甘油用量對微膠囊化的影響 由圖3可知，當加入甘油小于4.0 mL時，隨著甘油量的增加，微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)也相應(yīng)的增加，包埋率呈現(xiàn)增高的趨勢。其主要原因在于：甘油在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，減輕了細胞外溶質(zhì)濃度升高所造成的細胞損傷，達到了保護的目的。在載體中加入細胞保護劑甘油，加強了冷凍干燥和復(fù)水后微囊中細胞的活性（Favaro-Trindade等，2011）。因此，添加甘油作為單一保護劑時，選擇4.0 mL較適宜。

圖3 甘油用量對微膠囊化的影響

2.1.4 甘露醇用量對微膠囊化的影響 由圖4可知，當加入的甘露醇用量小于3.0 mL時，隨著甘露醇量的增加，微膠囊中的活菌數(shù)也相應(yīng)的增加，包埋率也有所增加，當加入甘露醇用量大于3.0 mL時，隨著甘露醇量的增加，微膠囊中的活菌數(shù)反而減小，包埋率也隨之下降。因此，添加甘露醇作單一保護劑時，選擇3.0 mL較適宜。

圖4 甘露醇用量對微膠囊化的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 試驗結(jié)果直觀分析 由表2可見，零水平所代表的單因素試驗的最優(yōu)值即A2B2C3D1所得的包埋率值最大，為63.1%，而通過極差分析所得的最適條件是A3B2C2D1，即正交試驗中的第5組，包埋率為62.5%。利用正交試驗所選用的4種壁材制備微膠囊，在包埋過程中，溶液中的嗜酸乳桿菌菌體先到達多孔淀粉顆粒周圍，然后在通過甘油、葡萄糖和甘露醇等保護劑的作用下，再通過吸附力進入顆粒內(nèi)部的孔洞中，對嗜酸乳桿菌起到很好的保護作用（Nag等，2011）。

表2 正交試驗結(jié)果直觀分析

2.2.2 方差分析 通過對試驗結(jié)果的極差分析可以看出，4種因素的主次順序依次是：多孔淀粉用量（A）> 甘油用量（C）>甘露醇用量（D）>葡萄糖用量（B）。通過對試驗結(jié)果進行二次方差分析，結(jié)果如表3所示，可以明顯看出，因素A和C對結(jié)果具有顯著性影響，也就是說制備微膠囊所選用的4種壁材中，多孔淀粉用量和甘露醇用量對微膠囊的包埋率影響最大。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 驗證性試驗 為了優(yōu)選出制備微膠囊的最佳因素組合，分別以單因素試驗的最優(yōu)值即A2B2C3D1和通過極差分析所得的最優(yōu)條件即A3B2C2D1進行3次重復(fù)性試驗，所得包埋率結(jié)果如表4所示。

表4 微膠囊化壁材工藝驗證 %

由表4可以看出，因素組合為A3B2C2D1的方案可行，所以制備微膠囊所選用壁材的最佳工藝條件為：50 mL菌懸液中，采用多孔淀粉用量為6 g、葡萄糖5 g、甘油3.0 mL、甘露醇3.0 mL，此種方案所制備的微膠囊包埋率相對最高。

2.3 掃描電鏡 對嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑樣品進行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌被保護劑包覆而形成球狀顆粒，且微膠囊大小均勻，其表面比較致密，微生態(tài)制劑顆粒表面上有很多小孔，多孔淀粉上的這些小孔具有吸附作用，對嗜酸乳桿菌起到了很好的保護作用。但在掃描照片中仍出現(xiàn)了少量的團聚。這應(yīng)該是在微膠囊的制作過程中攪拌速率過小、或壁材量稍多、或保護劑之間的粘連作用等，造成微膠囊有一定的團聚。

2.4 貯存穩(wěn)定性分析 將制得的微生態(tài)制劑樣品[活菌數(shù)為（2.5±0.5）×108]和裸菌[活菌數(shù)為（1.0±0.5）×108] 分別放在 0、4、25、37 ℃的環(huán)境中（環(huán)境無特殊要求）保存，每隔一定時間對兩種樣品的活菌數(shù)進行計算，試驗結(jié)果如表5和表6。由表5可知，制劑組中，隨著儲藏時間的延長所有制劑樣品的活菌數(shù)均逐漸下降，但在4℃下貯存時，所計數(shù)得到的活菌數(shù)下降較為緩慢，相比于其他溫度下的保存結(jié)果，要適于保存。由表6可知，裸菌組中，所有樣品計數(shù)得到的活菌數(shù)下降劇烈，各溫度下3周后基本無存活，在25℃和37℃下，2周就基本無存活。因此，制劑的穩(wěn)定性明顯高于裸菌，在4℃的環(huán)境中，嗜酸乳桿菌的活性保存的比較好。

表5 微生態(tài)制劑的貯存穩(wěn)定性 cfu/g

3 結(jié)論

目前，微生態(tài)制劑已經(jīng)在食品加工及各種養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，但南方鲇飼用微囊化嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑的研究少見。壁材選擇和制備工藝參數(shù)的優(yōu)化是決定微膠囊性能的關(guān)鍵因素。因此，本研究重點優(yōu)化選擇適宜的壁材和濃度，利用真空冷凍干燥技術(shù)制備微膠囊，優(yōu)化工藝參數(shù)，通過掃描電鏡照片分析表明，嗜酸乳桿菌被均勻的包裹，且大小均勻，有著很好的包裹率，經(jīng)過穩(wěn)定性分析，表明制劑的貯藏穩(wěn)定性明顯高于裸菌，且所制得的微生態(tài)制劑在4℃下貯存時，穩(wěn)定性較好。

表6 裸菌的貯存穩(wěn)定性 cfu/g

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