枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性改良研究進(jìn)展

和小黑，張文舉，魏曉燕

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是當(dāng)今酶生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的菌種之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的酶占整個(gè)酶市場(chǎng)的50%。由于枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)酶量高、種類(lèi)多、安全性好和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，其在現(xiàn)代酶制劑生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵生產(chǎn)的酶類(lèi)已經(jīng)在飼料、食品、紡織等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。一般自然界中存在的野生型菌株產(chǎn)酶量普遍較低，且酶的穩(wěn)定性較差，如何提高菌株的產(chǎn)酶性能是普遍關(guān)心問(wèn)題。因而培育、誘變、基因工程等技術(shù)不斷地被研究者們用來(lái)嘗試提高菌株的產(chǎn)酶性能。

1 枯草芽孢桿菌所產(chǎn)酶類(lèi)

枯草芽孢桿菌是一類(lèi)廣泛分布于不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性桿狀好氧型細(xì)菌，在土壤和植物的表面普遍存在。菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，其中就包括多種酶類(lèi)。研究表明，枯草芽孢桿菌能分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等十幾種酶類(lèi)（David等，1997）。這些活性酶能降解植物飼料中非淀粉多糖和大分子蛋白，提高飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用率，還可以補(bǔ)充動(dòng)物內(nèi)源酶的不足，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能（王振華，2008）。

2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性改良法

2.1 微生物培養(yǎng)法

2.1.1 液體發(fā)酵條件改良法 枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)嚴(yán)重影響其產(chǎn)酶性能。培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分能改善枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)特定的代謝途徑，從而提高酶的產(chǎn)量和活性。其中碳源和氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶活性的影響最大，選擇合適的碳源和氮源也顯得尤為重要。常見(jiàn)作為碳源的物質(zhì)有葡萄糖、淀粉、蔗糖等，常見(jiàn)的氮源有尿素、豆粉、蛋白胨等。同時(shí)發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間等也對(duì)其產(chǎn)酶性能有較大影響。全桂靜和尹黎獻(xiàn)（2011）對(duì)選育的高產(chǎn)低溫堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵條件為葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉 3 g/L，pH 8.0，接種量 5%，裝液量 20 mL（50 mL三角瓶），30℃發(fā)酵28 h時(shí)，酶活力最高，達(dá)2231 U/mL。Irfan等（2012）對(duì)產(chǎn)木聚糖酶枯草芽孢桿菌BS05深層發(fā)酵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)靜置發(fā)酵時(shí)，使用底物為米糠，碳源為蔗糖，氮源為酵母膏，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵72 h時(shí)木聚糖酶活力最高，達(dá)到408 U/mL；在攪拌發(fā)酵時(shí)以甘蔗渣為底物在同樣培養(yǎng)基條件下，轉(zhuǎn)速為140 r/min，37℃發(fā)酵48 h，木聚糖酶活力最高，達(dá)439 U/mL。此外，研究者分別對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶（黃璠和蔡俊，2012）、淀粉酶（Poddar等，2012）、纖溶酶 （陳桂光等，2012）、 植酸酶 （Kammoun等，2012）、β-半乳糖苷酶（崔福綿等，1999）、纖維素酶（Deka等，2011）等的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化均能不同程度地提高酶活性。

2.1.2 固體發(fā)酵條件改良法 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)簡(jiǎn)單且來(lái)源廣泛，多為便宜的天然基質(zhì)或工農(nóng)業(yè)副、廢產(chǎn)品，如麩皮、薯粉、棉粕、大豆餅粉、高粱、玉米粉等，經(jīng)發(fā)酵后不僅可以增加產(chǎn)酶量，還可以消除部分抗?fàn)I養(yǎng)因子、改善蛋白質(zhì)品質(zhì)等，從而提高飼料的利用率。由于固體發(fā)酵過(guò)程中無(wú)廢水、廢氣產(chǎn)生，與液體發(fā)酵相比減少了脫水、干燥等能源的大量耗費(fèi)，故污染少、能耗低、技術(shù)較簡(jiǎn)單，因而得到廣泛的應(yīng)用（Elbendary，2006）。固體發(fā)酵產(chǎn)酶活性的大小主要受發(fā)酵底物、底物初水分、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值等因素的影響。許多研究表明，對(duì)枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵條件進(jìn)行改良也可以提高枯草芽孢桿菌酶的活性。Khandeparker等（2011）用海洋細(xì)菌枯草芽孢桿菌cho40發(fā)酵麥麩，研究發(fā)現(xiàn)在pH 6.0、發(fā)酵溫度60℃時(shí)，木聚糖酶的活性達(dá)到最高。吳暉等（2008）研究了枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵豆粕中蛋白酶活力的影響，結(jié)果表明在料水比1∶1 （V/V）、pH 7.0、 接種量 4%、30 ℃發(fā)酵 72 h條件下發(fā)酵豆粕，底物中蛋白酶活力最高，達(dá)到630 U/g。董緒燕等（2008）采用LB培養(yǎng)基活化的枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜籽餅，發(fā)酵初始pH 7.0，發(fā)酵時(shí)間24 h條件下得到的溶栓酶其活性提高到83.32 U/g。 Huzairy 和 Khairiah（2012）分別以油棕櫚殼和稻秸為底物，比較發(fā)酵后枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶的活力，并對(duì)其發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明以稻秸為底物發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶活力高于油棕櫚殼，達(dá)到276 U/g。Unakal等（2012）用產(chǎn)α-淀粉酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵香蕉皮，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值進(jìn)行優(yōu)化，α-淀粉酶的活力提高到7.93 U/mL·min。

2.2 枯草芽孢桿菌菌株基因改造法

2.2.1 誘變育種 隨著對(duì)遺傳變異現(xiàn)象認(rèn)識(shí)的深入，出現(xiàn)了通過(guò)誘變劑提高誘變頻率的育種技術(shù)。誘變育種技術(shù)是通過(guò)物理、化學(xué)技術(shù)人為地使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，從中選育高產(chǎn)菌株。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、速度快、收效大等優(yōu)點(diǎn)，而且誘變手段多樣，所以是實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)上最為常用的高產(chǎn)菌株的育種方式。常見(jiàn)的誘變方法有：激光、X-射線、Y-射線快中子、紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）等。利用誘變的方法提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶性能，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有不少成功的報(bào)道。在化學(xué)誘變方面，孫金鳳等（2008）研究表明，經(jīng)硫酸二乙酯（DES）誘變處理 50 min后，篩選得到的枯草芽孢桿菌突變株 DES-4其殼聚糖酶活是原菌株的 2.7倍。Chand等（2004）用溴乙錠和NTG復(fù)合誘變，選育出突變菌株CMV5-A10，其濾紙酶活、羧甲基纖維素（CMC）酶活分別是野生菌的2.2和2.1倍。在物理誘變方面，謝鳳行等（2009）采用紫外誘變的方法對(duì)枯草芽孢桿菌H4和H5進(jìn)行連續(xù)誘變篩選產(chǎn)淀粉酶高的突變株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一次誘變后突變株的酶活分別為原始菌株的107%和111%；經(jīng)過(guò)第二次誘變后，H4的突變株H4Ⅱa，H5的突變株H5Ⅱa和H5Ⅱb的產(chǎn)酶能力有很大程度的提高，分別為原始菌株的147%、136%和135%，說(shuō)明紫外連續(xù)誘變有利于突變株產(chǎn)酶能力的提高。宋鵬等（2011）以產(chǎn)復(fù)合酶枯草芽孢桿菌QLB6為出發(fā)菌株，利用氦-氖（He-Ne）激光進(jìn)行誘變育種，獲得1株編號(hào)為QLB6F的菌株，其纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活力較出發(fā)菌株分別提高219%、38%和71%。

目前也有學(xué)者將化學(xué)誘變與物理誘變相結(jié)合，也得到良好的效果。李然等（2008）從小麥根際土壤中分離到一株對(duì)多種植物病原真菌有拮抗作用且產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌T2，經(jīng)UV和DES誘變處理，獲得具有良好遺傳穩(wěn)定性的蛋白酶正負(fù)突變株。與出發(fā)菌株相比，培養(yǎng)48 h的正突變株胞外蛋白酶活力提高108.5%，負(fù)突變株蛋白酶活力降低81.1%。Zhang（2012）通過(guò)UV和亞硝酸鈉溶液復(fù)合誘變枯草芽孢桿菌，突變菌株經(jīng)發(fā)酵后角蛋白酶活力提高了75.9%。

2.2.2 基因工程法 隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程為菌種產(chǎn)酶性能改良開(kāi)辟了一條新途徑。該方法主要是對(duì)菌株的產(chǎn)酶基因進(jìn)行改造，從而改善其產(chǎn)酶活性，是提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶性能的一種便捷、有效的方法。它實(shí)現(xiàn)了超遠(yuǎn)緣雜交，是一種最新最有前途的育種方法。

目前，在國(guó)內(nèi)外通過(guò)基因工程方法來(lái)提高產(chǎn)酶性能已經(jīng)有許多成功的例子。馬磊等（2005）用枯草桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子P43構(gòu)建了大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達(dá)載體pYG43，利用這種載體表達(dá)枯草桿菌纖維素酶產(chǎn)量比原宿主菌（B.subtilis1A747）提高了5～7倍。Kim等（2000）利用DNA改組融合技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)使得枯草桿菌內(nèi)切酶突變體的活性提高5倍。Liu等 （2012）將枯草芽孢桿菌TCCC11286的堿性果膠酶基因進(jìn)行克隆，將果膠酶基因插入表達(dá)載體pWB980構(gòu)成重組質(zhì)粒pWB-Apel，然后將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌WB600，在50℃、pH 9.0時(shí)經(jīng)搖床發(fā)酵后酶的活力高達(dá)445 U/mg。Guan等（2013）將枯草芽孢桿菌X1漆酶基因進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)漆酶在堿性和高溫條件下仍具有較好酶活力。

2.3 添加化學(xué)因子的方法

2.3.1 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶活性的影響 枯草芽孢桿菌所產(chǎn)酶的活性也受到一些金屬離子的影響。金屬離子能以不同的方式與底物、酶的活性產(chǎn)物和酶本身產(chǎn)生極強(qiáng)的親和力，從而導(dǎo)致酶活性的改變。有些離子能對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用，有些則激發(fā)酶的催化功能。因而在培養(yǎng)基中適量添加一定濃度的具有激活酶催化作用的金屬離子，如Ca2+、Mg2+、Na+、K+等，能夠一定程度地提高枯草芽孢桿菌酶的活性。

2.3.2 非離子表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶活性的影響 研究表明，非離子表面活性劑能夠提高酶的活性及穩(wěn)定性，其主要原因可能是因?yàn)檫@些分子提高了酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)合性，從而提高催化效果。目前對(duì)非離子表面活性劑的應(yīng)用很多，然而促進(jìn)枯草芽孢桿菌酶活性的報(bào)道較少。Poddar等（2012）對(duì)產(chǎn)耐高溫β-淀粉酶枯草芽孢桿菌DJ5的產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.03%的賴(lài)氨酸能夠顯著的提高β-淀粉酶的活力。Evan和Abdullahi（2012）研究表明，在產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中添加吐溫-80，可以使蛋白酶的活力提高5倍，同時(shí)也提高了蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

3 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性改良方法的優(yōu)缺點(diǎn)

枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶性能改良技術(shù)目前已取得了令人矚目的成就，但其發(fā)展過(guò)程中仍存在不少問(wèn)題。通過(guò)培養(yǎng)條件改良法來(lái)提高酶活力雖有效，但僅改善了枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的外部環(huán)境，菌株本身的產(chǎn)酶能力并沒(méi)有改善，因而提高能力有限。誘變育種方法盡管可以獲得酶活性較高的突變株，但其穩(wěn)定性較差，并且誘變后可能會(huì)出現(xiàn)正、負(fù)突變，有很大的盲目性，而且基因變異的程度也有限，進(jìn)一步提高酶活性受到了限制。所以要獲得酶活性提高很大的突變株，仍需進(jìn)行大量的誘變篩選工作，才有望獲得更為理想的穩(wěn)定的突變株 （潘風(fēng)光等，2005）。基因工程技術(shù)是目前最有效的提高產(chǎn)酶性能的方法，具有目的性和直接性。但其操作復(fù)雜，技術(shù)還不夠成熟，目前仍處于探索階段。向培養(yǎng)基中添加金屬離子或表面活性劑能顯著提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性，操作簡(jiǎn)便，效果顯著。然而其作用機(jī)理尚未明確，仍需要進(jìn)一步研究。

4 展望

目前，枯草芽孢桿菌酶已是酶市場(chǎng)的主體，如何快速、有效地提高產(chǎn)酶的活性，以滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求，是亟待解決的問(wèn)題。雖然目前對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性的改良技術(shù)已取得一定的成績(jī)，但效果并不理想，而且技術(shù)方面也存在著許多問(wèn)題。相信隨著科技的發(fā)展，基因工程、現(xiàn)代分子生物技術(shù)的進(jìn)步，有望篩選出更高產(chǎn)酶活性的枯草芽孢桿菌菌株，同時(shí)隨著酶制劑在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，低成本、大規(guī)模的酶生產(chǎn)將成為今后酶工業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)，因此，酶制劑的開(kāi)發(fā)具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。

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