重組人促紅細胞生成素預處理對體外循環(huán)手術中心肌的保護作用

王曉進，危小良，張 希，劉云奇

（1.中山大學附屬第五醫(yī)院胸心外科，廣東珠海 519000；2.中山大學附屬第五醫(yī)院心內科，廣東珠海 519000；3.中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州 510080）

重組人促紅細胞生成素預處理對體外循環(huán)手術中心肌的保護作用

王曉進1，危小良2，張 希3△，劉云奇3

（1.中山大學附屬第五醫(yī)院胸心外科，廣東珠海 519000；2.中山大學附屬第五醫(yī)院心內科，廣東珠海 519000；3.中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州 510080）

目的探討重組人促紅細胞生成素（rHuEPO）預處理對體外循環(huán)（CPB）手術中心肌的保護作用、機制及安全性。方法選擇30例擬行瓣膜置換術的風濕性心臟病患者，將其分為觀察組和對照組，觀察組術前2d給予皮下注射rHuEPO 300 IU／kg，1次／天，共2d；對照組給予等量生理鹽水。檢測術前及術后第7天血常規(guī)，以及術前、主動脈開放后6、24、72h血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白T（cTnT）水平。術畢心肌活檢，檢測心肌細胞凋亡指數。記錄CPB時間、主動脈阻斷（ACC）時間、ICU停留時間、輸血及術后并發(fā)癥情況。結果兩組患者術后CK-MB、cTnT均于主動脈開放后顯著升高，術后6h數值最高，其后呈下降趨勢。術后各時點觀察組CK-MB、cTnT水平均低于對照組，rHuEPO處理主效應兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.01）。心肌細胞凋亡指數觀察組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。觀察組沒有導致術后血紅蛋白（Hb）、血細胞比容（Hct）明顯升高和增加血栓栓塞的風險，并減少術后輸血量。結論rHuEPO預處理對CPB手術中的心肌具有保護作用，可減少心肌細胞凋亡，具有安全可靠性。

紅細胞生成素，重組；心??；細胞保護；再灌注損傷；體外循環(huán)

缺血再灌注損傷是一種普遍存在的病理、生理現(xiàn)象，在體外循環(huán)（CPB）心臟停搏直視手術中，心肌的缺血再灌注損傷會引起術后并發(fā)癥，例如：低心排綜合征、圍術期心律失常、多臟器功能衰竭等，嚴重者甚至危及生命。雖然目前臨床上已有聯(lián)合采取以高鉀心臟停搏、低溫、預防心肌水腫、心室充分減壓為主的多種心肌保護措施，術后效果仍然不理想，需要改進心肌保護的綜合措施。紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是機體在缺氧缺血的狀態(tài)下，主要由腎臟分泌，臨床上已經廣泛用于治療腎性貧血，除具有參與調節(jié)紅細胞的增殖、分化、成熟的功能外，還具有多種生物效應。動物實驗提示，EPO對神經細胞及視網膜細胞有保護作用［1－2］。隨機性臨床實驗表明，重組人促紅細胞生成素（rHuEPO）可以改善急性心肌梗死和慢性心力衰竭患者的心功能及有利于心室重構［3－4］。為探討rHuEPO預處理在CPB手術中是否有心肌保護作用，機制怎樣，安全性如何，本文于2010年8月至2011年3月選擇在中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科擇期行人工瓣膜置換術的風濕性心臟病患者，采用rHuEPO預處理，并探討其對CPB手術中心肌的保護作用、機制及安全性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年8月至2011年3月在中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科行擇期人工瓣膜置換術的風濕性心臟病患者30例。其中男14例，女16例；年齡23～72歲，平均（45.87±11.36）歲。入選標準：具有人工瓣膜置換術手術指征的風濕性心臟病患者，既往無EPO治療史，無手術禁忌證。告知患者rHuEPO預處理知情權并簽字同意。排除標準：（1）除心功能外有其他臟器功能嚴重障礙者；（2）糖尿病患者；（3）二級以上高血壓患者；（4）有血栓栓塞病史者；（5）惡性腫瘤患者；（6）同期行房顫射頻消融術或冠狀動脈旁路移植術（CABG）患者；（7）感染性心內膜炎患者；（8）術前血紅蛋白（Hb）＞160g／L，血細胞比容（Hct）＞50%者。將30例患者分為觀察組和對照組，每組15例。觀察組：男8例，女7例，rHuEPO預處理，二尖瓣置換12例，雙瓣置換3例；對照組：男6例，女9例，做空白對照，二尖瓣置換11例，雙瓣置換4例；兩組患者年齡、體質量、性別、心功能、術前左心室射血分數（LVEF）、Hb等臨床指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者術前一般資料比較（±s）

表1 兩組患者術前一般資料比較（±s）

組別 年齡（歲） 體質量（kg）術前LVEF（%）術前Hb（g／L）觀察組 45.13±12.31 52.87±7.86 61.53±8.87 132.20±18.32對照組 46.47±10.84 50.63±8.28 59.67±7.61 128.47±13.61

1.2 方法

1.2.1 預處理方法 觀察組：在術前2d給予皮下注射rHuEPO（益比奧，沈陽三生制藥）300IU／kg，1次／天，共2d；對照組：給予同等量的生理鹽水。兩組其他均按瓣膜病常規(guī)術前準備相同，調整心功能，葡萄糖－胰島素－鉀極化液（GIK液）心肌營養(yǎng)。

1.2.2 麻醉及手術方法 術前30min肌內注射嗎啡0.1 mg／kg，東莨菪堿0.3mg。麻醉誘導用咪達唑侖、依托咪酯、舒芬太尼、順式阿曲庫胺，氣管插管后實施舒芬太尼、丙泊酚靜脈復合麻醉，吸入七氟醚，順式阿曲庫胺維持肌松。肝素化后依次于主動脈、上下腔靜脈插管，主動脈根部插灌注針，右上肺靜脈置入左心引流管，阻斷上下腔靜脈，心表冰屑降溫，阻斷升主動脈，灌注冷血含鉀停跳液，首次20mL／kg，心臟停搏。淺低溫（28～32℃）轉機，主動脈阻斷超過30min，再次半量灌注停搏液，采用Edward Affinity成人型膜式氧合器。術中常規(guī)超濾，灌注流量60～80mL·kg－1·min－1，灌注壓維持在60～90mm Hg。均采用美國ATS公司機械瓣膜，間斷褥式縫合，左心系統(tǒng)操作結束后開放升主動脈，復溫至36.5℃，循環(huán)穩(wěn)定后停CPB。

1.2.3 觀察指標 （1）手術前及術后第7天采靜脈血測定血常規(guī)記錄 Hb、Hct。（2）手術前及主動脈開放后6、24、72h（各時點分別記為T0、T6、T24、T72）采取靜脈血，采用電化學發(fā)光法分別測定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）及肌鈣蛋白T（cTnT）水平。（3）停機時右心耳心肌活檢，免疫組織化學檢測，采用末端脫氧核苷酰轉移酶介導的三磷酸脫氧尿甘缺口末端生物素標記（TUNEL）細胞凋亡原位檢測試劑盒，嚴格按試劑盒操作步驟進行，最后蘇木素染色，光學顯微鏡觀察凋亡細胞，400倍鏡下計數10個視野，計算細胞凋亡指數（AI）＝凋亡細胞數／視野所有細胞總數×100%。（4）記錄各組CPB時間、主動脈阻斷（ACC）時間、輸血量、ICU停留時間及不良事件的發(fā)生情況（血栓栓塞、心律失常、低心排綜合征等）。在Hct＜25%時，給予輸注紅細胞。術后1周復查心臟彩色多普勒超聲，記錄LVEF值。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數據資料采用±s表示，根據數據特點：重復測量資料采用重復測量的方差分析方法統(tǒng)計分析；滿足正態(tài)分布和方差齊性時行兩組獨立樣本的t檢驗，方差不齊時行矯正t檢驗；非正態(tài)分布行兩組獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者手術相關指標比較 兩組患者CPB時間、ACC時間、術后心律失常（觀察組3例，對照組5例）、ICU停留時間、術后1周LVEF比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。兩組患者均順利出院，均無死亡、血栓栓塞及繼發(fā)性高血壓發(fā)生。

表2 兩組患者手術相關指標比較（±s）

表2 兩組患者手術相關指標比較（±s）

組別 CPB時間（min） ACC時間（min） ICU（d） 術后LVEF（%）觀察組 109.67±27.98 66.20±18.42 1.67±0.72 55.93±10.48對照組 116.00±27.74 70.67±23.20 1.97±0.64 53.07±6.43

2.2 兩組患者各個時點的血清cTnT、CK-MB水平比較 兩組患者術前cTnT、CK-MB水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術后均于主動脈開放后顯著升高，T6時點數值最高，其后呈下降趨勢。術后各時點觀察組CK-MB、cTnT水平均低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（rHuEPO處理主效應P＝0.01，時間主效應P＜0.01）。處理主效應和時間效應的交互作用，兩組患者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.009），見表3。

表3 兩組患者血清cTnT、CK-MB水平比較（±s，ng／mL）

表3 兩組患者血清cTnT、CK-MB水平比較（±s，ng／mL）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與 T6 比較；－：測量值小于檢測標準。

cTnT CK-MB時間點觀察組 對照組T0觀察組 對照組3.35±0.81 3.03±0.84 T6 0.78±0.27a1.16±0.43 42.13±14.87a59.30±17.76 T24 0.53±0.20a0.85±0.42 30.69±13.73a42.61±15.62 T72 0.35±0.14ab 0.49±0.19b 4.77±1.29ab 6.04±2.17－－b

2.3 兩組患者心肌AI比較 觀察組心肌細胞AI明顯低于對照組，二者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。兩組患者手術用血量［濃縮紅細胞（cRBC）］比較，觀察組術后輸血量少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術后1周兩組患者 Hb、Hct比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 兩組患者心肌細胞AI及手術輸血等比較（±s）

表4 兩組患者心肌細胞AI及手術輸血等比較（±s）

組別 心肌細胞AI（%） 輸cRBC（U） 術后Hb（g／L） 術后Hct（%）3.00±1.07 5.00±1.31 127.00±8.37 39.28±3.05對照組 6.73±1.49 6.93±2.25 123.07±6.51 38.06±2.32 P＜0.01 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05觀察組

3 討 論

CPB心臟停跳的狀態(tài)下完成心臟手術引起心肌的缺血再灌注損傷，增加術后出現(xiàn)低心排綜合征、圍術期心律失常、心肌梗死等并發(fā)癥的概率［5］。CPB轉流中人工管道對補體的激活，導致血管內皮功能障礙、炎癥細胞及炎癥因子大量釋放均可導致心肌細胞損傷。心肌在缺血缺氧的狀態(tài)下，三磷酸腺苷（ATP）的產生受到抑制，引起心肌細胞膜蛋白、線粒體等細胞器功能改變。當心肌恢復血流灌注時，因為氧反常、鈣反常、pH反常、炎癥細胞聚集，進一步加重心肌細胞功能障礙，破壞心肌細胞結構，稱為心肌再灌注損傷。CK-MB是肌酸激酶的同工酶，幾乎僅存于心肌細胞中，是診斷心肌損害的一個公認的敏感性指標，早期診斷頗有價值［6］。cTnT特異存在于心肌細胞肌原纖維絲中肌鈣蛋白復合物T亞單位，在心肌受損后能快速釋放入血，在心肌損傷中具有高度的特異性和敏感性。二者作為重要的心肌損傷標志物可以用以診斷、預后判斷及療效評價［7］。本研究比較觀察組和對照組手術后的心肌損傷標志物，結果顯示，cTnT、CK-MB水平術后均于主動脈開放后顯著升高，術后各時點觀察組CK-MB、cTnT水平均低于對照組，rHuEPO處理主效應P＝0.01，這說明rHuEPO預處理可以減輕心肌細胞的損傷程度，具有心肌保護作用。rHuEPO能有效減輕CPB手術中心肌缺血再灌注損傷。

Renzi等［8］動物研究提示，EPO保護作用是通過抗凋亡途徑實現(xiàn)的。抗凋亡是通過以下信號通路實現(xiàn)的：（1）EPO與EPOR結合，引起酪氨酸激酶（JAK2）磷酸化并活化，引起下游信號轉導和轉錄激活因子-3／5（STAT-3／5）等信號通路的磷酸化，促進細胞內的內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及環(huán)氧合酶－2（COX-2）翻譯表達，最終減少細胞的程序性死亡，抑制靶細胞凋亡［9］。（2）激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt），Akt進一步激活eNOS促進抗凋亡的關鍵因子一氧化氮（NO）產生，參與調控細胞周期和細胞凋亡等［10］。（3）活化ERK1／2后可以激活eNOS和鳥甘酸環(huán)化酶及蛋白激酶C，發(fā)揮抗氧化、抗凋亡等保護作用［11］。（4）EPO可以增強細胞抗凋亡基因bel-2表達，抑制促凋亡基因caspase-3表達［12］。以上均從信號轉導機制上闡述了EPO抗凋亡途徑，為臨床研究提供了基礎理論依據。本研究通過測定心肌AI，檢測結果顯示CPB下的心肌缺血再灌注可以引起心肌細胞凋亡，但rHuEPO預處理比對照組明顯減少凋亡，二者的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明rHuEPO可通過抗凋亡作用，減少心肌細胞損傷，發(fā)揮心肌保護作用。秦川等［13］報道EPO預處理可以明顯提高缺血再灌注大鼠心肌抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶，從而減輕缺血再灌注引起的氧化應激，減少膜氧化損傷。本研究對心肌損傷特性標志物CKMB、cTnT的水平進行分析，結果提示rHuEPO預處理能明顯降低二者的血清水平，間接說明心肌細胞破壞減少，可能與rHuEPO能維持心肌細胞膜穩(wěn)定性有關。

rHuEPO可以增加Hct及Hb水平，引起高血壓和血栓形成，部分患者出現(xiàn)癲癇發(fā)作，發(fā)熱、嘔吐、感覺異常、呼吸急促等相關并發(fā)癥［14］。本研究結果表明，術前rHuEPO 300IU／kg，1次／天，共2d，沒有導致術后Hb、Hct明顯升高和增加血栓栓塞的風險，而且減少了術后輸血量。與對照組比較，觀察組輸血量明顯減少（P＜0.05）。說明在臨床治療中適當劑量的rHuEPO，可以發(fā)揮rHuEPO的組織保護作用同時，促紅細胞生成，減少異體輸血帶來的各種風險和并發(fā)癥，支持rHuEPO當前劑量在CPB手術中的安全性。

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Myocardial protective effects of recombinant human erythropoietin pretreatment on patients undergoing cardiopulmonary bypass

WangXiaojin1，WeiXiaoliang2，ZhangXi3△，LiuYunqi3
（1.DepartmentofCardiothoracicSurgery，F(xiàn)ifthAffiliatedHospital，SunYat-senUniversity，Zhuhai，Guangdong519000，China；2.DepartmentofCardiology，F(xiàn)ifthAffiliatedHospital，SunYat-senUniversity，Zhuhai，Guangdong519000，China519000；3.DepartmentofCardiacSurgery，F(xiàn)irstAffiliatedHospital，SunYat-senUniversity，Gangzhou，Guangdong510080，China）

ObjectiveTo investigate the myocardial protective effects，mechanism and safety of recombinant human erythropoietin（rHuEPO）pretreatment in the patients undergoing cardiac surgery with cardiopulmonary bypass（CPB）.MethodsThirty patients with rheumatic heart disease undergoing valve replacement surgery were randomly divided into the observation group and the control group，15cases in each group.The observation group was given rHuEPO 300IU／kg by hypodermic injection on preoperative 2d，once daily for twice.The control group was given the same dose of normal saline.The blood routine was performed before surgery and on postoperative 7d.The levels of creatine kinase isoenzyme（CK-MB）and troponin T（cTnT）were detected before operation，at 6，24，72hafter the aorta opening（T0，T6，T24，T72）.At the end of CPB，myocardial biopsy was conducted for detecting the myocardial apoptosis index（AI）.The CPB time，aortic cross clamp（ACC）time，postoperative ICU stay，blood transfusion and postoperative complications were recorded.ResultsThe level of postoperative CK-MB and cTnT in the two groups were significantly increased after the aorta opening，which at T6was highest，followed by a downward trend.The levels of CK-MB and cTnT at various time points in the observation group were significantly lower than those in the control group.The main effect of rHuEPO pretreatment had statistical difference between the two groups（P＝0.01）.Myocardial AI in the observation group was significantly lower than that in the control group，the difference showing statistical significance（P＜0.01）.The observation group had no risk leading to obviously increase postoperative Hb，Hct values and thromboembolism，but the postoperative blood transfusion amount was reduced.ConclusionrHuEPO pretreatment has the protective effect on myocardium in the patients undergoing cardiac surgery under CPB，which can reduce myocardial apoptosis and has safe reliability.

erythropoietin，recombinant；myocardium；cytoprotection；reperfusion injury；cardiopulmonary bypass

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.011

A

1671-8348（2014）10-1187-03

王曉進（1978－），主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事心肌缺血再灌注研究。△

，Tel：（020）87755766-8238；E-mail：zhangxisysu＠163.com。

2013-09-18

2013-12-29）

論著·臨床研究