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    與HBV preS1黏附相關(guān)的細(xì)胞受體的研究*

    2014-02-09 07:31:30王良宏楊國珍
    重慶醫(yī)學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:合酶磁珠微管

    王良宏,楊 麗,潘 衛(wèi),李 興,楊國珍△

    (1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州貴陽550009;2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖中心,四川成都610041)

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)嚴(yán)重危害人類健康,目前臨床常用的抗病毒藥物對慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的治療效果并不十分理想,藥物不能有效地阻止HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV感染早期,病毒與細(xì)胞相互作用的機(jī)制并不清楚,這可能會影響到藥物的設(shè)計(jì)與治療方案的更新。HBV通過外膜蛋白與肝細(xì)胞膜上的特異受體相互識別,黏附于細(xì)胞膜上[1],這種特異性的識別和黏附是HBV感染嗜性(組織和宿主特異性)的原因之一。大量研究顯示,HBV的preS1肽段不僅直接參與了病毒與細(xì)胞的結(jié)合,而且其作用是十分關(guān)鍵和必需的[2-3]。肝細(xì)胞受體識別位點(diǎn)在preS1的21~47表位[4-7]。本課題以人肝癌細(xì)胞(HepG2)為實(shí)驗(yàn)對象,采用免疫磁珠法分離與preS1肽段結(jié)合的受體蛋白[8],以期發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的受體蛋白,從而為HBV感染早期與細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 細(xì)胞株:HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。試劑:生物素標(biāo)記preS1肽段購自賽百盛生物公司,鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠購自柏匯申生物科技有限公司,細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞膜制備試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100U/mL,鏈霉素100mg/mL)的DEME高糖培養(yǎng)基,于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。

    1.2.2 細(xì)胞膜蛋白的提取 收集大約2×107個(gè)細(xì)胞,嚴(yán)格按照細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞膜制備試劑盒的說明書進(jìn)行提取。

    1.2.3 免疫磁珠法分離與preS1結(jié)合的蛋白 取2mg膜蛋白同300μL生物素標(biāo)記的preS1,加PBS至1mL,4℃孵育過夜。次日取出后加入濃度為0.15g/L的鏈霉親和素標(biāo)記磁珠300μL,補(bǔ)足PBS至1 200μL,37℃搖床孵育30min。將Epp管插入磁力架,吸出未結(jié)合的部分,然后用PBS將磁珠洗滌3次,棄PBS,加入裂解液30μL冰浴30min,將與preS1結(jié)合的蛋白裂解出來。

    1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白 將裂解的蛋白液用5%的濃縮膠,12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離,考馬斯亮藍(lán)R-250染色,UMAX掃描儀進(jìn)行掃描。

    1.2.5 質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索 選取在凝膠中顏色較深且重復(fù)性好的6條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。LC-MS/MS質(zhì)譜分析及檢索由中國科學(xué)院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

    2 結(jié) 果

    2.1 HepG2細(xì)胞膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白的分離結(jié)果2mg HepG2膜蛋白與300μg的preS1結(jié)合,經(jīng)300μL鏈霉親和素標(biāo)記磁珠獲得的結(jié)合蛋白,通過SDS-PAGE分離出了16條帶(圖1),(45~97)×103的有9條帶,>97×103的有5條帶,<20×103的有2條帶。

    2.2 HepG2細(xì)胞膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析 選取其中顏色較深且重復(fù)性好的6條帶(圖1)進(jìn)行了質(zhì)譜分析,成功分析出14個(gè)蛋白,除Act1p屬酵母菌科外,其余均為人的種屬。剩余的13個(gè)蛋白包含肌動蛋白β(actin,beta)、微管蛋白β(Tubulin,beta)、ATP合酶(ATP synthase)、微管蛋白α-1A鏈(Tubulin alpha-1Achain)、熱休克蛋白60(60kDa heat shock protein,HSP60)、角蛋白1(keratin 1)、keratin 10、表皮細(xì)胞角蛋白2(epidermal cytokeratin 2)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78(78kDa glucose-regulated protein precursor,GRP78)、熱休克蛋白70(Heat shock 70kDa protein 9,Mortalin)以及3個(gè)未命名的蛋白。質(zhì)譜鑒定獨(dú)立肽段數(shù)大于或等于2,評分小于或等于1E-5為結(jié)果可靠,各蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果,見表1。

    圖1 SDS-PAGE分離HepG2膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白

    表1 HepG2與preS1結(jié)合蛋白的質(zhì)譜結(jié)果

    3 討 論

    HBV嚴(yán)重危害人類健康,目前臨床常用的抗病毒藥物對CHB的治療效果并不十分理想,藥物不能有效地阻止HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV感染早期,病毒與細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究顯得尤為重要。

    本課題采用了免疫磁珠分離法,該方法是一種省時(shí)、省力、方便快捷的方法,可有效分離受體蛋白[8]。本研究成功分離鑒定出14種與preS1肽段結(jié)合的蛋白,主要包括以下幾類。(1)微管蛋白:微管蛋白β,微管蛋白α-1A鏈。微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分,它由微管蛋白β和微管蛋白α兩個(gè)亞基結(jié)合在一起。維持細(xì)胞的形態(tài),可影響膜內(nèi)細(xì)胞器的空間定位和分布,參與物質(zhì)運(yùn)輸及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。(2)線粒體相關(guān)蛋白:ATP合酶。線粒體上的ATP合酶是一個(gè)與ATP合成和水解相關(guān)的雙向酶復(fù)合物。ATP合酶主要存在于線粒體內(nèi)膜,但已有研究表明在細(xì)胞表面也存在ATP合酶[9],并且最近的研究表明ATP合酶可作為受體參與脂類代謝調(diào)控和腫瘤免疫標(biāo)志識別等[10]。(3)HSP:HSP60、Mortalin、GRP78。HSP是一類所有細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下,由熱休克基因編碼合成的序列高度保守的蛋白,且能夠?qū)垢鼮閲?yán)重的應(yīng)激損傷,這種現(xiàn)象稱為熱休克反應(yīng)。HSP 60作為線粒體蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)[11],涉及線粒體蛋白和大分子的組裝,有利于輸入蛋白的正確折疊,在線粒體基質(zhì)中正確的產(chǎn)生多肽。王芳等[12]在文中指出,HBV感染的肝細(xì)胞會釋放大量的可溶性HSP60分子,其表達(dá)水平與HBV-DNA水平呈正相關(guān)。Mortalin和GRP78均屬于HSP70家族。Mortalin主要定位于線粒體,參與天然免疫和獲得性免疫,有研究指出Mortalin是一種功能性膜蛋白,在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色。

    GRP78主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,但在細(xì)胞膜上也有表達(dá),細(xì)胞膜上的GRP78參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原提呈及病毒入侵等。有研究證實(shí)GRP78是2型登革熱病毒(dengue virus serotype 2)受體復(fù)合物的主要成分之一[13]。楊鳳等[14]通過激光共聚焦顯微鏡觀察到GRP78在細(xì)胞膜上均勻分布,并指出GRP78可能通過與preS1結(jié)合參與HBV早期感染過程,葛以躍等[15]聯(lián)合利用GST Pull-Down與現(xiàn)代蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了2種與preS1特異結(jié)合蛋白:GRP78和GRP75。以上的研究提示,GRP78在HBV感染初期黏附有著非常重要的作用,其在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原提呈等過程中發(fā)揮重要作用。GRP78能與preS1特異結(jié)合并且在肝細(xì)胞膜上表達(dá),可能參與HBV早期侵入肝細(xì)胞的過程,本研究擬將GRP78作為preS1的候選受體,下一步將對其在HBV早期感染中的作用機(jī)制進(jìn)行研究,為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與治療方案的更新打下基礎(chǔ)。

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