Aβ1～40、Aβ1～42與Aβ25～35在阿爾茨海默病模型復(fù)制中的評價

羅 磊 杜艷軍 孫國杰

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

阿爾茨海默病(AD)患者大腦皮質(zhì)彌散性萎縮，神經(jīng)元丟失，突觸減少，細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑(SP)和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)形成是其特征性病理變化。因此，建立能夠較好模擬AD患者行為學(xué)及組織病理學(xué)方面改變的動物模型是AD研究的重點(diǎn)之一,將有助于推動對AD 發(fā)病機(jī)制的研究及治療藥物的篩選。目前，在AD的模型復(fù)制中，大多集中在模擬AD主要病理特點(diǎn)之一，即SP的形成為主，多采用海馬注射Aβ1～42、Aβ1～40與Aβ25～35淀粉樣蛋白進(jìn)行模型復(fù)制。在動物實(shí)驗(yàn)中，模型是評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果的決定性依據(jù)，因此，能夠建立合適的AD模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。本文對比Aβ1～42、Aβ1～40與Aβ25～35的來源、結(jié)構(gòu)及與AD的特異性關(guān)系，分析三種模型各自的特點(diǎn)及其在模型復(fù)制中可能存在的差異性。

1 淀粉樣前體蛋白(APP)與AD

APP分子量110～135 kD，該蛋白的基因定位于人類21號染色體長臂的中段,為一個選擇性的夾板樣半單螺旋形的跨膜蛋白,長的等位體包含有770個氨基酸,由2個外顯子構(gòu)成,可在大多數(shù)組織中表達(dá)。短的等位體含有695個氨基酸,主要在大腦組織中表達(dá)。基因轉(zhuǎn)錄后通過不同剪接方式可以產(chǎn)生6 個以上轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:APP770、APP751、APP714、APP695、APP563、APP365等,前四者是主要形式,且均攜帶有相當(dāng)于Aβ的片段,后兩者不攜帶Aβ；其中APP770、APP751的mRNA 中攜帶Kuitz型蛋白酶抑制劑的密碼(KPI),其余四種產(chǎn)物不攜帶KPI〔1～3〕。

APP為一種含有多個功能區(qū),以一次跨膜形式存在的Ⅳ型糖蛋白。它由大的N-末端胞外區(qū)域,跨膜區(qū)及小的C-末端胞漿區(qū)組成。而APP胞外區(qū)又是由幾個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成,具有相對獨(dú)立的功能〔4〕。與AD密切相關(guān)的就是APP的Aβ區(qū)，APP蛋白研究的焦點(diǎn)也主要集中在這個區(qū)域。大約有40種各種長度的Aβ多肽,在一種接近生理的條件下,可溶性Aβ40或Aβ42最可能的結(jié)構(gòu)是由兩個α螺旋組成,中間經(jīng)過一個環(huán)連接。與這些可溶性Aβ相比,淀粉纖維中的Aβ主要是以β折疊的形式存在。從α螺旋到β折疊的形態(tài)轉(zhuǎn)換可能是Aβ形成淀粉纖維的一個結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。如Duch和Arctic突變,發(fā)生在Aβ的α螺旋區(qū),使α螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,從而轉(zhuǎn)變成β折疊的形態(tài)〔5〕。同時，體內(nèi)淀粉樣纖維的形成不僅僅與Aβ濃度或(和)Aβ42/40比例的升高有關(guān)而且與其他的因素,如金屬離子、糖基氨基甘氨酸和其他的細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。研究表明〔6〕,Aβ不僅是一個生理損耗過程的副產(chǎn)品,被認(rèn)為能調(diào)節(jié)離子通道的功能并且對神經(jīng)元正常運(yùn)作起一定的作用。而一些早期的研究認(rèn)為低濃度可溶性的狀態(tài)具有促生長作用〔7〕。但Kamenetz等〔8〕發(fā)現(xiàn)，從神經(jīng)元分泌的Aβ能夠?qū)ν挥|的活動有反應(yīng),Aβ能以負(fù)反饋的形式下調(diào)突觸傳遞。

2 Aβ與AD

目前，“Aβ假說”是AD發(fā)病的主要機(jī)制之一，已被廣泛接受，并且認(rèn)為Aβ聚集是AD發(fā)病過程中的關(guān)鍵機(jī)制，Aβ在特定腦區(qū)的聚集沉積是AD患者主要的病理變化，現(xiàn)已證實(shí)其神經(jīng)毒性，造成突觸損傷，神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致AD的發(fā)生〔9〕。曾經(jīng)存在兩種不同觀點(diǎn),一種觀點(diǎn)認(rèn)為Aβ沉淀可引起患者神經(jīng)組織退化；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為Aβ沉淀形成老年斑僅僅為神經(jīng)細(xì)胞損傷導(dǎo)致的結(jié)果,而不是發(fā)病的先決條件〔10〕。

Aβ是從APP的第672到711位殘基間裂解產(chǎn)生的片段。包含了Aβ的細(xì)胞外區(qū)的最后28個殘基及跨膜區(qū)的14個殘基(分別由16、17外顯子編碼)。正常情況下APP主要是由α-分泌酶與γ-分泌酶共同切割,產(chǎn)生非致病性的片段P3,不會形成Aβ。而當(dāng)編碼APP的基因發(fā)生突變或其他原因?qū)е娄?分泌酶活性異常增高時,APP則容易被β-分泌酶與γ-分泌酶共同切割產(chǎn)生Aβ，主要包括Aβ40和(或)Aβ42兩種分子,由39～43個氨基酸組成。Aβ42較Aβ40疏水性強(qiáng),更易聚集,更容易導(dǎo)致AD SP形成〔11〕。其神經(jīng)毒性作用主要與氧自由基代謝、與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、細(xì)胞凋亡等有關(guān)〔12〕。

3 模型評價

目前AD模型復(fù)制方法有損傷性動物模型、Aβ誘發(fā)AD動物模型、三氯化鋁動物模型、復(fù)合型動物模型、炎癥免疫動物模型、自然衰老動物模型、快速老化小鼠(SAM)動物模型、轉(zhuǎn)基因動物模型等〔13，14〕。通過海馬注射Aβ淀粉蛋白在AD模型復(fù)制方法中較為常用，注射藥物大多集中在Aβ1～42、Aβ1～40與Aβ25～35之間。因此，探討Aβ三種淀粉蛋白在模型復(fù)制中的差異及其與AD的特異性，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

綜上，雖然Aβ1～42、Aβ1～40與Aβ25～35均來源于APP，但是它們各自的結(jié)構(gòu)及與AD的特異性關(guān)系各不相同。其中Aβ40是腦質(zhì)膜和腦脊液中的正?？扇苄援a(chǎn)物,然而由于Aβ42具有疏水性，因此認(rèn)為Aβ42是淀粉樣斑塊成核過程中的關(guān)鍵因素。研究〔15〕發(fā)現(xiàn)，Aβ42在AD的發(fā)病早期發(fā)揮著重要作用，這與其擴(kuò)散性的斑塊緊密聯(lián)系；也有報道〔15〕認(rèn)為，Aβ42較Aβ40疏水性強(qiáng),更易聚集,認(rèn)為Aβ42是斑塊的核心蛋白，雖然Aβ40和Aβ42僅存在兩個氨基酸的差異,然而它們之間具有顯著的差異，通過電鏡觀察這兩種蛋白的纖維形成過程，可見在溶液中Aβ42更傾向于形成斑塊狀沉積,而Aβ40則易形成典型的纖維結(jié)構(gòu)，可能與Aβ42的相對更為緊密的二級構(gòu)象有關(guān)，靜電作用可能在Aβ42早期的聚集過程中起著重要的作用〔15〕。同時在AD的治療過程中，有研究發(fā)現(xiàn)〔16〕，通過Aβ42免疫APP轉(zhuǎn)基因小鼠可以有效預(yù)防淀粉樣斑塊、營養(yǎng)不良性神經(jīng)突及膠質(zhì)化的發(fā)展?？梢?，Aβ42不僅可以用于模擬AD，而且對抗Aβ42的方法同樣具有預(yù)防AD發(fā)展的作用；王建秀等〔17〕通過原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Aβ25～35、Aβ42采用傳統(tǒng)方法孵育7 d 后,原纖維聚集量很多,未見Aβ單體或寡聚體，而且Aβ42呈螺旋狀態(tài),纖維結(jié)構(gòu)規(guī)整；Aβ25～35纖維結(jié)構(gòu)較Aβ42短,未見典型的螺旋狀態(tài)；Aβ42寡聚體制備過程中觀察到經(jīng)六氟丙醇(HFIP)作用后Aβ42均以單體形式存在。Aβ42與二甲基亞砜(DMSO)共同孵育24 h原子力顯微鏡成像可見高約3.0 nm 的寡聚體；48 h后可見較多寡聚體,室溫作用72 h時寡聚體濃度較24 h時下降,而原纖維變長,生成更多分支?？梢娛覝剌^4℃條件更有利于Aβ1～42纖維結(jié)構(gòu)聚集。

綜上，Aβ1～42最佳注射使用時間是在室溫作用下72 h，源于其在72 h后原纖維可以變長，且有多種分支，更有利于沉淀，造成SP形成。雖然Aβ1～42與Aβ1～40均是針對AD的主要病理特點(diǎn)之一進(jìn)行的模型復(fù)制方法，從淀粉樣斑塊的沉積與預(yù)防方面，Aβ42效果較為優(yōu)于Aβ40；在實(shí)驗(yàn)動物選擇方面，有報道〔18〕發(fā)現(xiàn)，人的Aβ具有Aβ1～42,Aβ1～40等多種類型,其中以Aβ1～42最重要,而老年恒河猴AD腦中以Aβ1～40為主。因此，在動物選擇方面，Aβ42的選擇更傾向于鋸齒類動物如大鼠的模型復(fù)制；Aβ40的選擇更傾向于靈長類動物如恒河猴的模型復(fù)制；Aβ25～35與Aβ1～42所致的病理特點(diǎn)雖然不同，但是它們均可成功復(fù)制AD模型，因此可以根據(jù)所需研究的刺激因素與研究目的的不同而選用相對特異性較強(qiáng)的模型復(fù)制方法，至于刺激因素和研究目的與模型的選取之間的特異性研究尚需進(jìn)一步探討；Aβ25～35與Aβ1～42在相同條件下聚集狀態(tài)不同，Aβ25～35不僅比Aβ1～42纖維較短，而且其未形成典型的螺旋狀態(tài)，這些均可影響Aβ25～35纖維的聚集。雖然Aβ1～42、Aβ1～40和Aβ25～35均是針對AD的典型病理特點(diǎn)之一，且是常用的模型復(fù)制方法。但模型復(fù)制成功的關(guān)鍵點(diǎn)在于Aβ纖維聚集，即SP形成，而Aβ25～35顯然沒有Aβ1～42更能促進(jìn)SP形成，至于二者之間的差距需進(jìn)一步研究；從淀粉樣斑塊的沉積與預(yù)防方面，Aβ1～40的疏水性也不及Aβ1～42，因此可以認(rèn)為Aβ42更能模擬AD的發(fā)展過程，但是在動物選擇上要加以區(qū)分，至于其差異性需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Hayashi Y,Kashiwagi K,Ohta J,etal.Alzcheimer amyloid protein precursor enhances proliferation of neural stem cells from fetal rat brain〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1994；205(1)：936-43.

2Koning G,Monning U,Czech C,etal.Identification and differential express a novel alternative splice isoform of the βA4 amyloid precursor protein(APP)mRNA in leukocytes and brain microglial cells〔J〕.J Boil Chem,1992；267(15)：10804-9.

3Rebelo S,Henriques AG,Edgar F,etal.Effect of cell density on intracellular levers of Alzheimer’s amyloid precursor protein〔J〕.J Neurosci Res,2004；76:406.

4肖 飛,羅煥敏.淀粉樣前體蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009；29(23):3144-7.

5Morgan C,Colombres M,Nunez MT,etal.Structure and function of amy-loid in Alzheimer′s disease〔J〕.Prog Neurobiol，2004；74(6)：323-49.

6Etcheberrigaray R,Kim CS,Alkon DL.Soluble β-amyloid induction of Alzheimer′s phenotype for human fibroblast K+channels〔J〕.Science,1994；264(5156)：276-9.

7Yankner BA,Duffy LK,Kirschner DA.Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid protein：reversal by tachykinin neuropeptides〔J〕.Science,1990；250(4978)：279-82.

8Kamenetz F,Tomita T,Hsieh H,etal.APP processing and synaptic function〔J〕.Neuron,2003；37(6)：925-37.

9Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:progress and problems on the road to therapeuties〔J〕.Science,2002；297:353-6.

10Marx J.Boring on β-amyloid role in Alzheimer’s disease〔J〕.Science,1992；255(2):688.

11Junq SS,Nalbantoglu J,CashmanNR.Alzheimer’s beta-amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo brain cells:a flow cytometric study〔J〕.J Neurosci Res,1996；46(3):336-48.

12張寧寧,丁 也,桑 亮.β-淀粉蛋白的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2008；24(17)：2605-6.

13謝 寧,宋琳莉,牛英才，等.老年性癡呆動物模型研究進(jìn)展及其評價〔J〕.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2006；26(1):50-3.

14徐劍文,俞昌喜.阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)性動物模型的研究進(jìn)展〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·老年醫(yī)學(xué)分冊,2008；29(3):97-103.

15武一,吉尚戎,蔣伍玲.β淀粉樣蛋白1-40和1-42的聚集性質(zhì)比較〔J〕.電子顯微學(xué)報,2003；22(1):21-5.

16Schenk D,Barbour R,Dunn W，etal.Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathologyin the PDAPP mouse〔J〕.Nature,1999；400(6740)：173-7.

17王建秀,王德生,段淑榮,等.原子力顯微鏡觀察不同Aβ 聚集狀態(tài)的研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜,2008；18(1):33-5.

18Sani S,Traul D,Klink A,etal.Distribution,progression and chemical composition of cortical amyloid beta deposits in aged rhesus monkeys：similarities to the human〔J〕.Acta Neuropathol(Berl),2003；105(2)：145-56.