內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)在心血管疾病中的致病作用*

趙艷霞綜述，格日力審校

內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)在心血管疾病中的致病作用*

趙艷霞綜述，格日力審校

二聚體結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）氧化L-精氨酸生成一氧化氮（NO），后者對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。血管內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，脫偶聯(lián)的eNOS產(chǎn)生超氧化物而非NO，導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷，進(jìn)而引起多種心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展。深入了解eNOS脫偶聯(lián)與心血管疾病的關(guān)系，對預(yù)防和治療心血管疾病具有重要意義。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶；脫偶聯(lián)；心血管疾?。灰谎趸?/p>

目前已發(fā)現(xiàn)的一氧化氮合酶（NOS）有三種同工酶，分別是神經(jīng)型NOS（nNOS或NOS-I）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS或NOS-Ⅱ）和內(nèi)皮型NOS(eNOS或NOS-Ⅲ）。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在心肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、腎臟管狀細(xì)胞和其他器官也有表達(dá)[1]。心血管系統(tǒng)的正常功能有賴于eNOS的保護(hù)。eNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO通過擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、減少白細(xì)胞粘附實現(xiàn)維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血壓、抗炎及預(yù)防動脈粥樣硬化的作用[2]。血管內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，脫偶聯(lián)的eNOS產(chǎn)生超氧化物（O2-）而非NO，導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷，進(jìn)而引起多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。深入了解eNOS脫偶聯(lián)與心血管疾病的關(guān)系，對預(yù)防和治療心血管疾病具有重要意義。

1 內(nèi)皮型一氧化氮合酶分子結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)

eNOS是一種結(jié)合輔因子的同源二聚體，這種結(jié)構(gòu)是其催化L-精氨酸和活性氧（O2）產(chǎn)生L-瓜氨酸和NO所必需的。每個eNOS亞基有兩個結(jié)構(gòu)區(qū)，即氧化區(qū)和還原區(qū)。N-端為氧化區(qū)，含有四氫生物蝶呤（BH4）、L-精氨酸和血紅素的結(jié)合位點。連接eNOS兩個亞基的是鋅指結(jié)構(gòu)，由鋅離子（Zn2+）和每個亞基的兩個半胱氨酸殘基構(gòu)成。C-端為還原區(qū)，含有與黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、黃素單核苷酸（FMN）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）結(jié)合的位點。每個亞基氧化NADPH為NADP+產(chǎn)生電子，電子被傳遞到氧化區(qū)的血紅素[3]。氧化區(qū)和還原區(qū)的連接處為鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合的區(qū)域，當(dāng)結(jié)合兩分子的CaM時，激活eNOS，將電子的傳遞給L-精氨酸，生成NO。

翻譯后經(jīng)十四烷?；妥貦磅；揎椀膃NOS與小窩蛋白-1（Caveolin-1）結(jié)合，使得eNOS定位于質(zhì)膜小窩，即質(zhì)膜的凹陷處，此時eNOS處于失活狀態(tài)。刺激因素通過Ca2+激活CaM并與eNOS結(jié)合，促使eNOS從Caveolin-1上解離并從小窩轉(zhuǎn)位到胞漿，轉(zhuǎn)位后的eNOS功能上調(diào)。eNOS不同氨基酸位點的磷酸化作用不同。磷酸化絲氨酸（Ser）1177是改變酶對Ca2+敏感性及產(chǎn)生過氧化物和NO比例的關(guān)鍵位點，磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）直接磷酸化Ser1177可增強(qiáng)熱休克蛋白90（HSP90）與eNOS的結(jié)合，進(jìn)而提高eNOS的活性，促進(jìn)NO的產(chǎn)生。磷酸化CaM結(jié)合區(qū)域的蘇氨酸（Thr）495位點，通過抑制CaM與eNOS結(jié)合而抑制eNOS的激活。另外，磷酸化FMN結(jié)合區(qū)域的Ser633位點可以增加Ser1177磷酸化及Ca2+激活的eNOS的活性。磷酸化Ser114和Ser615的功能尚存在爭議[3]。

BH4和L-精氨酸是eNOS重要的輔因子，BH4能保持血紅素結(jié)合位點功能正常；增加eNOS與L-精氨酸結(jié)合力；穩(wěn)定eNOS二聚體的結(jié)構(gòu)與活性。另外，BH4具有較強(qiáng)還原性，可清除活性氧（ROS）和過氧化亞硝基[4]。鋅指結(jié)構(gòu)也能夠保證BH4結(jié)合位點的完整性，另外，小窩內(nèi)的L-瓜氨酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)長-精氨酸循環(huán)再利用，以保證eNOS底物的充足，并穩(wěn)定其二聚體結(jié)構(gòu)[5]。

2 脫偶聯(lián)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶

eNOS脫偶聯(lián)是指在各種因素作用下，eNOS的四級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，由兩個亞基偶聯(lián)的同源二聚體結(jié)構(gòu)變?yōu)橐粋€亞基的單體結(jié)構(gòu)。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可見eNOS二聚體減少，單體與二聚體的比值增加[6]。脫偶聯(lián)的eNOS產(chǎn)生O2-而不是NO，以產(chǎn)生的O2-為中心會使損傷效應(yīng)不斷放大，O2-氧化NO為氧化性更強(qiáng)的過氧亞硝基（ONOO-），進(jìn)而氧化eNOS的輔因子使其數(shù)量減少或功能障礙，導(dǎo)致更多的eNOS脫偶聯(lián)，產(chǎn)生更多的O2-，降低NO的生成和生物利用度，損傷血管內(nèi)皮，進(jìn)而引起心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展。eNOS脫偶聯(lián)的因素主要包括BH4或L-精氨酸含量不足，鋅指結(jié)構(gòu)破壞，氧化應(yīng)激損傷。其中氧化應(yīng)激損傷與eNOS脫偶聯(lián)的關(guān)系結(jié)合在以下幾點中敘述。

2.1四氫生物蝶呤與內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)

BH4是穩(wěn)定eNOS活性的重要輔因子。BH4合成方式有兩種，即從頭合成和補(bǔ)救合成。從頭合成是以三磷酸鳥苷（GTP）為原料，在鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶1（GTPCH1）和墨蝶呤還原酶（SR）的作用下合成BH4。GTPCH1是該反應(yīng)中的限速酶，因為BH4合成的調(diào)節(jié)通過改變轉(zhuǎn)錄水平來實現(xiàn)，所以BH4的合成很大程度依賴于GTPCH1的表達(dá)。某些炎性因子可以增加轉(zhuǎn)錄水平，比如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、干擾素-γ及脂多糖（LPS）。GTPCH1連同Caveolin-1與eNOS定位在細(xì)胞小窩，它能連續(xù)的提供BH4。在哺乳動物中，補(bǔ)救合成主要通過二氫葉酸還原酶(DHFR)和二氫生物蝶呤還原酶(DHPR)實現(xiàn)。DHFR主要激活葉酸為5-甲基四氫葉酸，同時可以將BH2還原為BH4。DHPR可以將醌式BH2還原為

BH4不足時，eNOS脫偶聯(lián)，因而失去正常產(chǎn)生NO的能力而產(chǎn)生超氧化物。產(chǎn)生的超氧化物會氧化剩余的BH4為BH2，導(dǎo)致血管中BH4含量減少，而BH2含量增多，BH2又是BH4的拮抗劑，這將會增加eNOS脫偶聯(lián)，進(jìn)一步增多活性氧（ROS）的產(chǎn)生和NO的減少。同時，超氧化物會與生成的NO反應(yīng)，生成ONOO-[7]。另外，增加酶的活性，比如NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶等的活性增加會觸發(fā)超氧化物自由基生成的級聯(lián)反應(yīng)，其中連續(xù)生成的過氧硝酸基ONOO-氧化BH4為BH3，增加eNOS脫偶聯(lián)，進(jìn)而產(chǎn)生更多的自由基。過氧亞硝酸基會不可逆的使其他蛋白的酪氨酸殘基硝化，使其磷酸化受損及酶的功能紊亂[8]。

若只增加eNOS的表達(dá)而沒有平行的增加BH4，即相對的BH4不足，會因輔因子與酶的比例失衡而導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)[9]。所以保持eNOS與BH4的比例平衡對于脫偶聯(lián)很重要，有研究表明降低BH4水平可激活核轉(zhuǎn)錄因子-E2-相關(guān)因子，降低人內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白水平，故保持eNOS與BH4的比例平衡，使eNOS處于偶聯(lián)狀態(tài)，因而降低了ROS的生成[10]。在保持eNOS/BH4比值恒定的情況下，增加細(xì)胞內(nèi)BH2濃度將明顯的增加eNOS依賴的超氧化物的生成，因此，eNOS脫偶聯(lián)不單純?nèi)Q于eNOS/BH4比值，還與細(xì)胞內(nèi)BH4/BH2比值有關(guān)系。Crabtree等[11]研究顯示鼠科動物內(nèi)皮細(xì)胞中含有大量的DHFR，若用甲氨蝶呤降低該酶的活性，或基因敲除DHFR，導(dǎo)致BH4氧化為BH2，繼而eNOS脫偶聯(lián)。DHFR可將BH2還原再生為BH4，如此保持較好的BH4/BH2比值來穩(wěn)定eNOS的偶聯(lián)狀態(tài)，尤其在BH4和BH2較少的情況下。

2.2L-精氨酸與內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)

L-精氨酸在保持eNOS偶聯(lián)中的必要作用尚存在爭議。因為血漿L-精氨酸濃度是在體激活eNOS所需濃度的30倍[11]。另外，L-精氨酸自身可以被細(xì)胞循環(huán)再利用。精氨酸酶增加細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸的分解，引起局限的、亞細(xì)胞的L-精氨酸含量降低。因此，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的精氨酸酶可與eNOS競爭其底物，降低eNOS的作用。eNOS的抑制劑非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）直接抑制eNOS，同時也抑制內(nèi)皮細(xì)胞攝取L-精氨酸。因此，降低L-精氨酸與ADMA比值可降低eNOS產(chǎn)生的NO。有研究顯示，在人動脈和靜脈中，血清ADMA水平與eNOS偶聯(lián)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。此外，增加血漿ADMA濃度與血管氧化壓力及內(nèi)皮功能失調(diào)的發(fā)生有關(guān)[12,13]。如此，改變ADMA而不是L-精氨酸可觸發(fā)eNOS脫偶聯(lián)。而另有研究表明在BH4不足時，ADMA可使eNOS脫偶聯(lián)，增加ROS產(chǎn)生，但是在L-精氨酸充足時不會出現(xiàn)這樣的結(jié)果[14]。ADMA升高與L-精氨酸不足均可使eNOS脫偶聯(lián)而增加ROS的產(chǎn)生，所以在生理情況下，ADMA可能與eNOS脫偶聯(lián)無關(guān)。

2.3鋅指結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)

鋅指結(jié)構(gòu)由一個Zn2+與來自eNOS每個亞基的兩個半胱氨酸殘基構(gòu)成，位于eNOS的氧化區(qū)，等距于每個亞基的血紅素，能保持BH4結(jié)合位點的完整性。鋅指結(jié)構(gòu)突變會阻止Zn2+、BH4、L-精氨酸的結(jié)合，使eNOS失活，提示鋅指結(jié)構(gòu)穩(wěn)定二聚體對酶的活化非常重要。用過氧亞硝基處理分離的eNOS，過度產(chǎn)生的NO和O2-相互反應(yīng)，氧化鋅指結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)。Chen等[7]認(rèn)為BH4穩(wěn)定二聚體不需要Zn的參與，因為盡管過氧亞硝基處理失去Zn2+的結(jié)合，降低eNOS的活性，但是用Zn的螯合物孵化并未改變eNOS的活性。

3 內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)對心血管系統(tǒng)的影響

高血壓與心力衰竭：eNOS基因表達(dá)影響小鼠的血管張力，因此成為血壓調(diào)節(jié)的重要因素，eNOS基因缺失引起高血壓，而eNOS基因過表達(dá)則降低血壓。高血壓大鼠存在eNOS脫偶聯(lián)，逆轉(zhuǎn)eNOS脫偶聯(lián)為二聚體的eNOS，可增加大鼠主動脈NO生物活性，降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[15]。對于高血壓患者，少量連續(xù)口服BH4制劑可降低收縮壓、平均動脈壓，改善內(nèi)皮功能和氧化壓力[16]。另有研究證實eNOS脫偶聯(lián)在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)模型中起關(guān)鍵作用，eNOS脫偶聯(lián)可引起心肌肥厚和纖維化，降低心肌收縮力，引起心力衰竭。經(jīng)口給予BH4可抑制eNOS脫偶聯(lián)，增加NO產(chǎn)生，并減少ROS的產(chǎn)生，可預(yù)防或逆轉(zhuǎn)心室肥厚、纖維化，改善心功能[17]。需要解釋的是因為eNOS-/-小鼠沒有eNOS，也就沒有脫偶聯(lián)的eNOS及其依賴的超氧化物產(chǎn)生，所以eNOS-/-小鼠在壓力超負(fù)荷情況下心肌肥厚、擴(kuò)張和纖維化均較輕[18]。

糖尿?。篹NOS脫偶聯(lián)與糖尿病的關(guān)系密切，既往實驗研究有一矛盾的現(xiàn)象，即在鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病模型動物血管eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)是上調(diào)的，而NO沒有相應(yīng)的增加，且同時存在內(nèi)皮功能障礙。在糖尿病模型動物中eNOS脫偶聯(lián)的發(fā)現(xiàn)可以合理解釋這一矛盾。高血糖可增加O2

-的產(chǎn)生，進(jìn)而增加ADMA的生成，ADMA抑制L-精氨酸的作用，導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，NO生成減少，超氧化物生成增多，增加血管氧化壓力，降低NO的生物利用，導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮功能失調(diào)[19]。另外糖尿病增加的氧化壓力也可過多的氧化BH4為BH2，使 BH4缺乏，引起eNOS脫偶聯(lián)，血管修復(fù)能力降低，進(jìn)而加重糖尿病內(nèi)皮損傷，補(bǔ)充BH4可改善內(nèi)皮依賴性血管舒張障礙[20]，或補(bǔ)充葉酸刺激DHFR增加BH2的還原，逆轉(zhuǎn)eNOS脫偶聯(lián)，近而預(yù)防糖尿病心臟功能失調(diào)[21]。動物實驗證明BH4不足還可能與內(nèi)皮GTPCH1表達(dá)下調(diào)及降解加速有關(guān)，在鏈脲霉素誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠中，AMPK的減少導(dǎo)致26S蛋白酶體的活性異常，引起GTPCH的降解加速。臨床治療糖尿病常用藥物二甲雙胍即是通過上調(diào)AMPK來抑制26S蛋白酶體對GTPCH的降解保持eNOS活性，從而改善血管功能，降低2型糖尿病患者的死亡率[22]。

動脈粥樣硬化：eNOS脫偶聯(lián)是動脈粥樣硬化（AS）的重要機(jī)制之一。eNOS脫偶聯(lián)降低NO的產(chǎn)生，減少其對血管的保護(hù)作用，既往實驗證明eNOS基因敲除或使用其抑制劑可加速實驗動物AS的形成；另外eNOS脫偶聯(lián)生產(chǎn)超氧化物，增加氧化壓力，促進(jìn)AS的形成。用低密度脂蛋白（LDL）孵育內(nèi)皮細(xì)胞或在體高脂血癥，可直接增加內(nèi)皮細(xì)胞氧化壓力，也可激活內(nèi)皮的血管緊張素Ⅱ，后者提高NADPH氧化酶表達(dá)，二者均可引起B(yǎng)H4氧化，也減少DHFR對BH4的循環(huán)利用，導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，使得NO產(chǎn)生減少，氧化壓力增加，損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)AS的形成與進(jìn)展[23]。Antoniades等[24]用冠狀動脈疾?。–AD）患者做搭橋手術(shù)的大隱靜脈和腸系膜動脈研究，發(fā)現(xiàn)血漿生物喋呤水平與血管的生物喋呤水平呈負(fù)相關(guān)；血管BH4與血管ROS呈負(fù)相關(guān)，與eNOS偶聯(lián)及NO調(diào)節(jié)的血管功能呈正相關(guān)；血漿BH4同樣與血管損傷程度和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平正相關(guān)，外源性補(bǔ)充BH4可改善高膽固醇血癥兔的內(nèi)皮功能紊亂[25]。另外，促炎因子和GTPCH1單體的特異性也與eNOS脫偶聯(lián)有關(guān)。促炎因子可明顯的增加血漿生物喋呤的水平，卻不能增加內(nèi)皮中生物喋呤的水平，使eNOS脫偶聯(lián)，引起內(nèi)皮功能失調(diào)?；颊咛禺惖腉TPCH1單體決定血漿及血管中BH4的水平，GTPCH1單體被3個單核苷酸多態(tài)性位點決定，啟動子區(qū)域的rs8007267G/A，內(nèi)含子1的rs3783641A/T和3′端非翻譯區(qū)的rs10483639C/G。特異的GTPCH1單體與eNOS脫偶聯(lián)，增加血管超氧化物生成及降低內(nèi)皮功能有關(guān)，是AS獨立的影響因素[26]。

缺血性心臟?。貉趸瘔毫υ谛募」Ｋ溃∕I）后心肌重塑的細(xì)胞水平上起關(guān)鍵作用。既往研究提示，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，eNOS過表達(dá)的小鼠，MI后心肌重塑的程度減輕，而eNOS-/-小鼠則重塑加重[27]。NO可增加MI后血管生成，減少纖維化的生成。eNOS部分通過減輕心肌細(xì)胞肥大而減輕MI后左心室功能失調(diào)及重塑。研究證實MI模型大鼠梗死后心肌重塑還與非梗死心肌的超氧化物形成有關(guān)，Yaoita等[28]報道用冠狀動脈結(jié)扎的方法建立大鼠心肌缺血模型，補(bǔ)充BH4可增加eNOS活性，降低心肌中性粒細(xì)胞活性，保護(hù)炎癥浸潤心肌的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，這主要歸功于eNOS改善冠狀動脈內(nèi)皮功能，由此改善心肌灌注。所以補(bǔ)充BH4以調(diào)整eNOS偶聯(lián)可作為治療心肌缺血性損傷的治療方法，該方法可改善冠狀動脈灌注及減輕心肌重塑來保護(hù)心臟功能。另外，eNOS二聚體與單體的比值可以提示MI后eNOS脫偶聯(lián)的發(fā)生，補(bǔ)充外源性BH4后eNOS二聚體與單體的比值上升，eNOS脫偶聯(lián)減輕。大劑量口服補(bǔ)充BH4可改善缺血再灌注損傷對內(nèi)皮功能的影響[29]。

心血管老化：衰老引起的eNOS脫偶聯(lián)及NO的生物利用降低可能是導(dǎo)致內(nèi)皮依賴血管舒張功能降低及血壓升高的原因。研究發(fā)現(xiàn)老齡大鼠骨骼肌阻力動脈BH4水平及生物利用度降低，可能引起eNOS脫偶聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮依賴血管舒張功能降低，超氧化物產(chǎn)生增多[30]。補(bǔ)充BH4或其底物墨蝶嶺可使eNOS復(fù)偶聯(lián)，增加NO的產(chǎn)生，進(jìn)而改善老齡小鼠內(nèi)皮功能[31]。Sindler等[32]發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練可通過平衡NO與ROS的產(chǎn)生預(yù)防衰老導(dǎo)致的BH4丟失并改善NO的生物利用度，從而改善eNOS脫偶聯(lián)引起的內(nèi)皮功能損傷。

eNOS脫偶聯(lián)在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，因此針對eNOS脫偶聯(lián)和（或）其觸發(fā)因素的對策可能是預(yù)防和治療冠心病、心力衰竭、動脈粥樣硬化、糖尿病及高血壓等心血管疾病的有效手段，如阻斷ROS的產(chǎn)生，補(bǔ)充BH4，補(bǔ)充葉酸以使BH2再循環(huán)為BH4，補(bǔ)充L-精氨酸等。

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2013-11-27）

（助理編輯：許菁）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.31160219）；國家國際合作項目（No.2011DFA32720）；國家973 計劃項目（No.2012CB518200）

810001 青海省西寧市，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院

趙艷霞 講師 主要從事心血管病基礎(chǔ)研究 Email: zhaoyanxia--03@163.com 通訊作者：格日力 Email:geriligao@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2014）04-0315-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.021