用于體外實驗的內(nèi)皮細胞系研究進展

熊 斌 郭云亮 譚 巖 方艷秋 付 嘉

(濟寧醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院外科總論教研室，山東 濟寧 272067)

所有的血管，包括從最大的動脈和靜脈到最小的毛細血管后微靜脈，其內(nèi)表面都襯貼著內(nèi)皮細胞。這些內(nèi)皮細胞的功能很大程度上依賴于細胞的定位以及相應(yīng)血管的大小〔1〕。內(nèi)皮細胞不只是被動的屏障，還可主動轉(zhuǎn)運小分子、巨分子和激素，并能降解脂蛋白顆?！?〕。在血壓調(diào)節(jié)、血液凝固和纖維蛋白溶解、炎細胞從血管進入靶組織所進行的黏附和移行、腫瘤血管發(fā)生和新生血管形成中內(nèi)皮細胞進一步起主要作用，所以有人提出內(nèi)皮細胞是一種條件性的固有免疫細胞〔2〕。另外有研究顯示，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、川崎病等自身免疫病患者血中存在的自身抗體作用的靶器官也是內(nèi)皮細胞。內(nèi)皮細胞功能異常會導(dǎo)致多種病理過程：動脈粥樣硬化、出血疾病、自身免疫病、移植排斥甚至胎兒損傷死亡〔3～6〕。隨著人們對內(nèi)皮細胞在生理和病理情況中所起到的作用越來越感興趣，對在血管功能狀態(tài)、血凝、腫瘤血管生成、淋巴細胞黏附和移行、跨血管壁和淋巴管壁的信號傳輸路徑等體外研究的模型系統(tǒng)中起代表作用的內(nèi)皮細胞有了更高的需求。

1 內(nèi)皮細胞可作為體外研究的模型

我們對內(nèi)皮細胞功能的了解大部分來自于對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)〔7〕。HUVEC平均壽命為傳代10次，可以培養(yǎng)5個月〔8〕。而后細胞進入“衰老”階段，細胞停止增殖，趨于形成巨大、多核的細胞最后死亡。所以用HUVEC做長期的體外實驗是不可能的。分離原代HUVEC辛苦費力，而且由于供者來源不同，分離的不同HUVEC株所得的實驗結(jié)果相互之間沒有可比性。人胎盤內(nèi)皮細胞(HPEC)〔9〕顯示有別于HUVEC的形態(tài)學(xué)特征：細胞更為伸展，在稀疏的培養(yǎng)中形成網(wǎng)絡(luò)，在長至匯合時拉長的細胞形成延伸的紡錘形結(jié)構(gòu)，甚至在原來單層細胞表面形成管狀結(jié)構(gòu)。對實驗條件標(biāo)準化和實驗結(jié)果可重復(fù)性的要求使我們越來越需要永生性的、穩(wěn)定表現(xiàn)內(nèi)皮細胞特點的細胞系。然而，要求理想的永生細胞系顯示原代細胞的所有特性對細胞本身就是矛盾的。獲得永生性的細胞即使不是發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)變，也是一種非生理性變化的跡象。尋找內(nèi)皮細胞系的目的就是要找到表現(xiàn)盡可能多的原代內(nèi)皮細胞特點而盡可能少的腫瘤細胞特性。尋找內(nèi)皮細胞系時要避免出現(xiàn)退行性變和腫瘤特點如非整倍和不穩(wěn)定染色體組、軟瓊脂培養(yǎng)基生長和對裸鼠的致瘤性。

將內(nèi)皮細胞用于系列實驗時，我們必須確定哪些特性對證明實驗設(shè)計的有效性很重要，哪些特性有利于簡化實驗步驟。比如說在做蛋白的產(chǎn)生和純化的實驗時要選擇血清或無蛋白培養(yǎng)基，細胞衰老和永生性機制的檢測要用延長但有限壽命的細胞系，而且有穩(wěn)定的染色體組或端粒酶表達細胞系。研究血液-內(nèi)皮相互作用時要首選表達特異性黏附分子或凝血途徑成分如組織因子(TF)或組織型纖溶酶原激活物(tPA)和(或)顯示淋巴細胞黏附的細胞系。適合血管生成研究細胞系應(yīng)該是具有Matrigel管形成，接觸抑制和錨定依賴。還有些細胞系具有所來源患者器官和病理情況的特點。研究Kaposi肉瘤(KS)應(yīng)選擇KS來源的細胞系，研究血腦屏障應(yīng)用腦微血管細胞系。

細胞系通常分為兩類：延長壽命的內(nèi)皮細胞系：克服了衰老，但在危機存在時會死亡；永生性內(nèi)皮細胞系：危機時也可存活，形態(tài)和抗原穩(wěn)定表達。永生性細胞系通過轉(zhuǎn)染、感染或與永生細胞融合而獲得更長的壽命，較HUVEC更實用，所以應(yīng)用比較多。然而在研究內(nèi)皮細胞衰老時就不能用永生細胞系了。這些細胞多出現(xiàn)于永生細胞系產(chǎn)生前，而且都沒有被用于血管相關(guān)研究，關(guān)于這些細胞特性的資料也很少。

已建立的永生細胞系可被進一步分為“大血管內(nèi)皮細胞”，“小血管內(nèi)皮細胞”和“無血管內(nèi)皮細胞”。后者指的是骨髓內(nèi)皮細胞或分離自患者損傷處或腹水的病理性內(nèi)皮細胞。

2 延長壽命的內(nèi)皮細胞

Gareed和Gimbrone〔〕轉(zhuǎn)染HUVEC產(chǎn)生SVHEC。用SV40感染HUVEC，Ide等獲得了SV-HUVEC。通過分離艾滋病患者Kaposi肉瘤內(nèi)皮細胞，Salahuddin〔〕等得到AIDS-KS和AIDS-KS6細胞系。而后又出現(xiàn)了SV-2、SGHEC-7。Hohenwarter〔〕報道了兩個未命名的細胞系及EC-pSV1，后者是HUVEC與人骨肉瘤細胞系134B融合而成的，其他的是用SV40基因轉(zhuǎn)染HUVEC建立的。隨后建立的5個細胞系：ESV108、2010-GF、2010ECGS、233和ESV2010INS、EGF在有無生長因子的條件下均可生長。

少數(shù)的微血管非永生性細胞系之一是HPEC-A1，它由SV40基因轉(zhuǎn)染胎盤內(nèi)皮細胞而成。簡單地說，非永生長壽命的內(nèi)皮細胞最適宜的模型是SV-2，Hohenwarter的兩個未命名的細胞系和微血管細胞系HPEC-A1。然而，現(xiàn)在有許多永生性細胞系有更好的細胞特點，又有永生的優(yōu)點：穩(wěn)定的染色體組型和表型?；谶@些特點，長壽命內(nèi)皮細胞在需要非永生細胞進行研究時是最適合的。

3 永生細胞系

3.1大血管內(nèi)皮細胞 最為常用而又最具有內(nèi)皮細胞特點的人血管內(nèi)皮細胞系是EA.hy926〔10〕，是用HUVEC與人肺癌細胞系A(chǔ)549融合而建立起來的。這種雜合細胞較其祖代有更多的染色體并攜帶一個A549系的標(biāo)志染色體〔11〕。細胞生長時有接觸抑制，對生長因子的需求降低，用腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激時表達vWF并上調(diào)ICAM-1、VCAM-1和E-selectin，而白細胞介素(IL)-4和干擾素(IFN)-γ不能。EA.hy926還表達tPA、PAI-1、TF和TM。蛋白激酶C的誘導(dǎo)劑佛波醇-12豆蔻酸-13乙酸鹽(PMA)可上調(diào)其CD59表達，鈣離子載體A23187和蛋白激酶A誘導(dǎo)劑聯(lián)丁酰基環(huán)腺苷單磷酸酶。EA.hy926還用于黏附實驗與幾個人白細胞系，封閉單抗存在時的人外周血單核細胞(PMBC)，地塞米松存在的未刺激人中性粒細胞和鼠T細胞相互作用。Walkden等用EA.hy926研究內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化酶(ECE)的膜錨定特性。

另一個永生人內(nèi)皮細胞系是ECV-304〔12〕，1985年報道其來自于HUVEC常規(guī)培養(yǎng)的自發(fā)性轉(zhuǎn)化事件。最近有人對ECV-304的內(nèi)皮來源提出質(zhì)疑，細胞間接觸提示其部分表皮來源。最終Brown等提出ECV-304的遺傳學(xué)身份是膀胱癌來源的表皮細胞系T24/83。ECV-304不再被認為是內(nèi)皮細胞來源。

Faller等用小鼠肉瘤病毒假模建立了兩個穩(wěn)定的人內(nèi)皮細胞系HEC-KSV和HEC-MSV。Schwartz等用SV-40基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生永生性的靜脈內(nèi)皮細胞IVEC。Sasaguri等從死于肺癌的52歲男性分離了大動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)并用SV40病毒處理，得到SE-1。Cockerill等報道了一例HUVEC培養(yǎng)中發(fā)生的自發(fā)性轉(zhuǎn)化事件，得到細胞系C11STH。Fontijn等將人乳頭瘤病毒E6/E7整合入HUVEC使之永生化，產(chǎn)生EC-RF7和EC-RF24細胞系。Moldovan等將HUVEC永生化用于研究內(nèi)皮轉(zhuǎn)化酶ECE，如細胞系CEH。Tonqueze等融合了HUVEC和A549/8，得到兩個克隆Hy1和Hy2。Van Leeuwen等永生性細胞系EVLB3和EVLC2產(chǎn)生自HUVEC、EVLK1和EVLK2來自于人回腸靜脈內(nèi)皮細胞。

為了研究血管內(nèi)皮細胞老化和凋亡，人們用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染了一系列不同血管起源的原代內(nèi)皮細胞。HUVEC，人大動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)，人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)，人隱靜脈內(nèi)皮細胞(HSVEC)和人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HDMEC)經(jīng)轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得hTERT陽性克隆。轉(zhuǎn)化細胞呈鋪路石樣單層接觸抑制生長，表達vWF和PECAM-1、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin陽性，Matrigel管形成，攝取acLDL，在軟瓊脂培養(yǎng)基上不生長。轉(zhuǎn)化并不改變內(nèi)皮細胞的基因狀態(tài)。hTERT-HAEC細胞系與對照的親代內(nèi)皮細胞或轉(zhuǎn)染細胞相比，對凋亡誘導(dǎo)更不敏感，大血管內(nèi)皮細胞系仍然表現(xiàn)原代內(nèi)皮細胞的優(yōu)點，凋亡敏感性下降也是原代的表型。

3.2小血管內(nèi)皮細胞 微血管內(nèi)皮細胞分離自人胎盤新生包皮、成年人皮膚、脂肪組織和其他的微血管環(huán)境〔13,14〕。目前建立的微血管內(nèi)皮細胞很少，是用SV40大T抗原(HMEC-1，SV-HCEC)，多瘤病毒(iSEC或hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒(hTERT-HDMEC)轉(zhuǎn)染而成的。永生化的胚竇肝細胞(iSEC)，具有胚胎內(nèi)皮細胞的特征。表達細胞角蛋白7，8和18，提示其為間充質(zhì)起源。Ades等從人皮膚微血管內(nèi)皮細胞建立了一株細胞系CDC/EU.HMEC-1(通常叫HMEC-1)能在無血清條件下生長，細胞表現(xiàn)人微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)學(xué)，表型和功能特點。Yosef等〔15〕分離并永生化了腦微血管內(nèi)皮細胞(HCEC)，產(chǎn)生SV-HCEC。

3.3非血管內(nèi)皮細胞 人骨髓中包含內(nèi)皮細胞及其前體。當(dāng)骨髓細胞被某種藥物動員起來或從外周血分離時，骨髓相關(guān)內(nèi)皮細胞也同時被分離出來。內(nèi)皮細胞前體可從外周血中分離出來，在體外能發(fā)生分化，在體內(nèi)能形成內(nèi)皮細胞〔16〕,但至今未見永生細胞系的報道。這些內(nèi)皮細胞不能歸入小或大血管來源的內(nèi)皮細胞而自成一類。三個骨髓來源的內(nèi)皮細胞BMEC-1、TrHBMEC和HBME-1特性很相似，均由SV40基因轉(zhuǎn)染獲得。

3.4病理性內(nèi)皮細胞 Cooper等〔17〕提出細胞系SKHEP-1是內(nèi)皮細胞來源。SKHEP-1來自肝腺癌患者腹水。曾被報道說是肝細胞癌來源。然而，Northern雜交未見白蛋白、α和γ纖維蛋白原mRNA。電子顯微鏡顯示吞飲小泡，WP小體和大量的間絲。細胞不結(jié)合UEA，但表達vWF和E-selectin，形成Matrigel管，提示細胞系微內(nèi)皮細胞來源。

Liu等〔18〕從肝血管肉瘤建立細胞系HAEND，此患者是接觸氯化乙烯氣體40年的礦工，在接受肝移植后肝血管肉瘤復(fù)發(fā)。HAEND并沒有鋪路石樣形態(tài)，而是呈紡錘型，是肝血管肉瘤的形態(tài)特點，失去了接觸抑制，生長時不需要凝膠，纖粘蛋白和血清、vWF、ICAM-1、TF、補體受體3(CR3)、HLA-Ⅰ均為陽性，HLA-Ⅱ陰性。

綜上，目前對永生細胞系的選擇很多。最常用的和最具特點的是EA.hy926〔11〕和ECV304〔12〕，后者現(xiàn)已知并非內(nèi)皮細胞起源〔12〕。此后又報道了很多新的細胞系。例如IVEC在內(nèi)皮細胞標(biāo)志的表達和上調(diào)方面顯示與原代HUVEC高度的相似性，但卻含有SV40基因，C11STH有相似的特性但卻來自自發(fā)性突變事件。大、小血管hTERT細胞系有許多原代內(nèi)皮細胞的優(yōu)點而不顯示轉(zhuǎn)化表型。還有特殊的內(nèi)皮細胞系如血腦屏障細胞系SV-HCEC，肝竇細胞系Isec或骨髓來源的BMEC-1細胞系和TrHBMEC-1。HMEC-1是最早的微血管細胞系，廣泛用于不同的內(nèi)皮研究，具有原代微血管內(nèi)皮細胞的許多優(yōu)點。

Lidington等將三種常用的內(nèi)皮細胞系HMEC-1、ECV304和EA.hy926與原代內(nèi)皮細胞進行對比。作者對比了涉及淋巴細胞和單核細胞相互作用及跨內(nèi)皮移行的表面抗原的表達，提出HMEC-1與原代內(nèi)皮細胞最相近，ECV304與原代內(nèi)皮細胞相差最遠。這與ECV304具有成瘤特性甚至不是內(nèi)皮細胞起源的報道相一致，故而ECV304作為內(nèi)皮細胞體外模型比較缺乏吸引力。

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