卵巢組織玻璃化冷凍的研究進(jìn)展

王勁松，左 琴，范 濤，李保文

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

隨著我國(guó)生命科學(xué)的快速發(fā)展，體外受精、核移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作等胚胎工程技術(shù)對(duì)卵源的需求量大幅增加，卵巢組織的凍存技術(shù)使卵母細(xì)胞的收集保存得以實(shí)現(xiàn)，并且卵巢組織的凍存不受年齡、生殖周期的影響，甚至可以從死亡的動(dòng)物獲得，是行之有效的保存卵母細(xì)胞的方法。近年來(lái)，新的基因打靶技術(shù)(如TALENs和CRISPR)日漸成熟，為基因工程動(dòng)物的制作提供了便利，從而極大地豐富了疾病模型動(dòng)物的資源，為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究及新藥研發(fā)篩選提供了有力保障，但豐富的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源也對(duì)保種方法提出新的要求；此外，一些疾病模型動(dòng)物繁殖力低甚至無(wú)繁殖力的情況時(shí)有發(fā)生。卵巢冷凍保存可以通過(guò)復(fù)蘇后移植、體外受精 (IVF)或胞質(zhì)內(nèi)精子注射 (ICSI)技術(shù)得到后代，是繼胚胎冷凍、精子冷凍后，又一有效保存實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源的方法。

1 卵巢組織的程序化冷凍與玻璃化冷凍

卵巢組織的冷凍是利用低溫使細(xì)胞降溫、脫水，形成非損傷性結(jié)冰，其分子運(yùn)動(dòng)速度降低、停止，組織細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，達(dá)到冷凍貯存的目的。目前常用的卵巢組織冷凍方法為程序化冷凍法和玻璃化冷凍法。程序化冷凍法是較為成熟的保存卵巢組織的方法，冷凍效果穩(wěn)定，但該方法需程序降溫儀來(lái)控制降溫速度，儀器價(jià)格昂貴，過(guò)程復(fù)雜，樣本處理數(shù)量少，并不適合對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源的保存；此外，在凍融過(guò)程中不可避免地在細(xì)胞內(nèi)、外形成冰晶，損傷細(xì)胞及細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，相互擠壓、變形甚至破裂死亡，影響組織結(jié)構(gòu)及活性。玻璃化冷凍是近十幾年新發(fā)展起來(lái)的冷凍保存技術(shù)，在快速降溫的過(guò)程中，與高濃度的冷凍保護(hù)劑混合的水分子沒(méi)有足夠時(shí)間排列成晶體結(jié)構(gòu)，并可迅速通過(guò)冷凍敏感區(qū)，形成介于液體和固體之間的高黏度非晶體的“玻璃化狀態(tài)”，可使液體分子的凝固呈無(wú)序排列，維持溶液的水分子和離子分布，跨膜物質(zhì)濃度和滲透壓差別較小，可以最大限度減少冰晶形成對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性損傷[1]和凍融效應(yīng)。Fahy等[2]將該過(guò)程描述為：“液體的黏度逐漸增加直到分子停止運(yùn)動(dòng)，從液態(tài)性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)性質(zhì)”。 Liebermann等[3]提出合適的冷凍速率會(huì)導(dǎo)致水分外流，形成細(xì)胞外的玻璃化現(xiàn)象。玻璃化冷凍技術(shù)簡(jiǎn)單、高效，已經(jīng)成功應(yīng)用于胚胎和卵母細(xì)胞的冷凍保存。1985 年 Rall 首先應(yīng)用玻璃化冷凍法成功凍融了小鼠胚胎，隨后該方法在胚胎、卵母細(xì)胞的凍存中開(kāi)展了應(yīng)用研究[4-6]，在20世紀(jì)90年代初期，學(xué)者對(duì)小鼠、大鼠、兔、猴、牛等的卵巢組織進(jìn)行了玻璃化冷凍研究，取得一系列的成功。

2 影響卵巢玻璃化冷凍的因素

2.1 卵巢組織的前處理

卵巢組織過(guò)大或過(guò)厚會(huì)影響冷凍保護(hù)劑的滲透，而且移植后需要更長(zhǎng)時(shí)間與受體動(dòng)物形成血管重建、恢復(fù)組織供血，易造成移植初期的組織缺血損傷，影響卵泡發(fā)育，甚至導(dǎo)致組織壞死。液氮的沸點(diǎn)為 -196℃，在玻璃化冷凍過(guò)程中，卵巢組織塊會(huì)在浸入液氮時(shí)導(dǎo)致液氮的沸騰而產(chǎn)生氮?dú)?，包圍卵巢組織，形成“蒸汽罩”，減緩熱傳遞，減緩組織降溫速率，引起細(xì)胞損傷，影響凍存效果。理論上，組織塊體積越小，其表面形成的“蒸汽罩”面積就越小，對(duì)凍存的效果的影響越小，但組織塊體積太小，會(huì)造成在切割處理時(shí)丟失較多卵泡，產(chǎn)生不能利用的組織塊。目前卵巢組織的處理大多為厚度約 1 mm，一般不超過(guò) 2 mm。有研究表明，在鼠類(lèi)動(dòng)物模型中，冷凍卵巢組織的一般大小為1 mm × 1 mm × 0.5 mm[7]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者將小鼠卵巢組織塊切成 1～3 mm3，均可較好地保存其原始卵泡和初級(jí)卵泡[8]。Gook等[9]認(rèn)為，將卵巢組織切割成 2.0～5.0 mm大小對(duì)于凍存結(jié)果影響不大，但可以保護(hù)體積較大的腔前卵泡。有學(xué)者對(duì)不同形狀的卵巢組織塊冷凍復(fù)蘇后的效果做了比較研究，Scott等[10]冷凍不同形狀的人類(lèi)卵巢組織，立方體形的組織塊較其他形狀的組織塊更早出現(xiàn)生長(zhǎng)較好的存活卵泡。Ishijima等[11]將卵巢組織處理為不同大小的立方體，觀察發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑對(duì)125 mm3卵巢組織仍可起到保護(hù)作用。

2.2 冷凍保護(hù)劑的選擇

合適種類(lèi)與濃度的冷凍保護(hù)劑對(duì)卵巢玻璃化冷凍至關(guān)重要。冷凍保護(hù)劑的種類(lèi)分為滲透性和非滲透性?xún)煞N，常用的滲透性冷凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PROH)、甘油、乙酰胺和甲醇等可以滲透到細(xì)胞內(nèi)的小分子類(lèi)物質(zhì)；非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是大分子物質(zhì)，主要包括糖類(lèi)、聚合物、血清及抗冷凍蛋白等。玻璃化冷凍保護(hù)劑的濃度較程序化冷凍保護(hù)劑高，高濃度的冷凍保護(hù)劑可以升高玻璃化溫度，在冷凍降溫過(guò)程中使細(xì)胞內(nèi)外水分子形成高黏度的“玻璃態(tài)”。同時(shí)高濃度冷凍保護(hù)劑具有更高的細(xì)胞毒性作用，增加對(duì)細(xì)胞的損傷。將不同的冷凍保護(hù)劑組合使用，利于其協(xié)同作用，提高整體濃度，保證冷凍效果，亦利于控制各組分的濃度，有效降低細(xì)胞毒性。滲透性冷凍保護(hù)劑中，乙二醇毒性較低，是應(yīng)用較廣泛的冷凍保護(hù)劑，但乙二醇在冷凍時(shí)形成“玻璃態(tài)”的能力較差。二甲基亞砜是較適合卵巢組織冷凍的保護(hù)劑，它分子量較小、滲透力強(qiáng)于乙二醇，但細(xì)胞毒性較大。有學(xué)者將二甲基亞砜與乙二醇、丙二醇混合使用，在卵巢的玻璃化冷凍保存研究中取得較好的效果[12-15]。蔗糖、海藻糖、棉子糖等糖類(lèi)及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚蔗糖、葡聚糖等聚合物是較常用的非滲透性冷凍保護(hù)劑，一般與滲透性冷凍保護(hù)劑聯(lián)合使用，可以減少滲透性冷凍保護(hù)劑的用量[16]，降低其細(xì)胞毒性。同時(shí)大分子物質(zhì)能夠提高冷凍液黏度，加快冷凍液玻璃化過(guò)程；并且能夠增加細(xì)胞外壓引起細(xì)胞脫水，防止冰晶的形成。此外，非滲透性冷凍保護(hù)劑還具有穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。高分子聚合物作為非滲透性冷凍保護(hù)劑能夠在細(xì)胞表面形成黏性膜狀結(jié)構(gòu)，在冷凍過(guò)程中阻斷冰晶形成，減輕冷凍及復(fù)溫對(duì)組織的損傷[17]。Hashimoto等[18]在卵巢的玻璃化冷凍保護(hù)劑中添加聚乙烯吡咯烷酮作為非滲透性冷凍保護(hù)劑，取得較好效果。Isachenko等[19]在將二甲基亞砜、乙酰胺、聚乙二醇及丙二醇聯(lián)合使用作為冷凍保護(hù)劑，具有較好的冷凍保存效果。動(dòng)物血清和抗凍蛋白的添加對(duì)卵巢的玻璃化冷凍效果也有積極地影響。

2.3 滲透平衡方法

卵巢組織結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，細(xì)胞在組織內(nèi)相互連接成團(tuán)，其中包括卵泡、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞等，冷凍保護(hù)劑對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的滲透作用存在差異，為使組織中不同類(lèi)型的細(xì)胞達(dá)到相同的冷凍保護(hù)劑濃度，適宜的滲透平衡的時(shí)間尤為關(guān)鍵，要保證足夠的時(shí)間使冷凍保護(hù)劑充分滲透到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)又要避免平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性。此外，滲透平衡的時(shí)間也取決于冷凍保護(hù)劑的濃度及溫度。較高濃度的冷凍保護(hù)劑能更好的降低液體的冰點(diǎn)，避免冷凍時(shí)結(jié)成冰晶損傷組織，但過(guò)高的冷凍液濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外過(guò)高的滲透壓差，產(chǎn)生細(xì)胞損傷。加入滲透性保護(hù)劑后，可降低液體的冰點(diǎn)，并且隨濃度升高其降低冰點(diǎn)的能力也升高，因此提高液體中冷凍保護(hù)劑的濃度可大大降低液體的冰點(diǎn)。但同時(shí)面臨的另一問(wèn)題是隨著胞內(nèi)溶質(zhì)濃度的升高其滲透壓也加大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的較高的滲透壓差進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。因此冷凍保護(hù)劑的濃度必須盡可能的高，使在胞內(nèi)冰晶形成之前細(xì)胞能更充分地脫水，但同時(shí)又要調(diào)整溶質(zhì)的滲透壓使其造成的有害影響較小。較高的溫度會(huì)增加冷凍保護(hù)劑的毒性，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的滲透平衡溫度在0℃～4℃，但也有學(xué)者認(rèn)為在較高的溫度下冷凍保護(hù)劑可以更快速地滲透，需要更少的平衡時(shí)間，反而會(huì)降低冷凍保護(hù)劑毒性[20]。

在卵巢組織浸入冷凍保護(hù)劑的滲透平衡過(guò)程中，要綜合分析所用冷凍保護(hù)劑的種類(lèi)、濃度確定平衡溫度及平衡時(shí)間，著重考慮其保護(hù)效果和細(xì)胞毒性，以減少冷凍過(guò)程對(duì)卵巢造成的損傷，保證凍存的效果。Newton等[21]的研究表明，以DMSO和EG用作冷凍保護(hù)劑，較適宜的平衡溫度為4°C，而PROH在37°C經(jīng)過(guò)30 min的滲透平衡，其滲透效果優(yōu)于DMSO和EG。Fabregues等[22]的研究也提出，在4°C時(shí)，相比PROH，DMSO和EG滲透進(jìn)入卵巢組織的速度更快。陳薪等[23]采用乙二醇和蔗糖兩步法，預(yù)平衡 10 min，將卵巢組織直接投入液氮進(jìn)行玻璃化冷凍，沒(méi)有造成細(xì)胞DNA的損傷。Gook[24]用1.5 mol/L的PROH及1.5 mol/L PROH + 0.1 mol/L蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，室溫下兩步平衡，預(yù)平衡10 min，也取得較好的凍存效果。Moniruzzaman等[25]、Santos等[26]、Wang等[27]均使用兩步平衡法，取得成功。

2.4 冷凍載體

冷凍管作為目前普遍采用的卵巢玻璃化冷凍載體，投入液氮時(shí)會(huì)使液氮沸騰在管周?chē)a(chǎn)生蒸汽，形成“蒸汽罩”，而且冷凍管壁較厚，其材質(zhì)熱傳導(dǎo)性也較差，影響降溫速率。理想的冷凍載體能保證卵巢組織塊的降溫速率，使其迅速通過(guò)冷凍溫度的危險(xiǎn)區(qū)，同時(shí)又能降低卵巢細(xì)胞形成“玻璃態(tài)”所需要的細(xì)胞內(nèi)液體濃度[28]，減輕冷凍保護(hù)液的細(xì)胞毒性。目前已有多種新的冷凍載體及操作方法被應(yīng)用到卵巢組織的玻璃化冷凍上，如電鏡銅網(wǎng)(EMG)[29]、尼龍網(wǎng)(nylon mesh)、冷凍環(huán)(cryoloop)[30]、冷凍載桿(crytop)、封口式拉長(zhǎng)麥管(CPS)、開(kāi)口式拉長(zhǎng)麥管(OPS)[31]、直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification，DCV)、固體表面玻璃化冷凍(solid surface vitrification，SSV)、針刺式載體浸入冷凍(needle immersed vitrification，NIV)等。中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者Chen等[32]采用DCV法冷凍小鼠卵巢組織，凍存效果優(yōu)于傳統(tǒng)的玻璃化冷凍方法：將經(jīng)過(guò)滲透平衡的卵巢組織放入凍存管底部后直接浸入液氮，蓋上凍存管蓋，隨即放入液氮罐中保存，該方法降溫速率可達(dá) 15 000 ℃/min。Zhou等[14]用DCV法冷凍人類(lèi)卵巢組織，冷凍效果與新鮮對(duì)照組相似。DCV法較傳統(tǒng)的玻璃化冷凍法大幅提高了冷凍時(shí)的降溫速率，但是卵巢組織與液氮直接觸，并沒(méi)有避免液氮沸騰形成的“蒸汽罩”，對(duì)冷凍速率仍然有影響。Dinnyes等[33]建立了SSV法，將經(jīng)過(guò)冷凍液滲透平衡后的卵巢組織放在預(yù)先浸入液氮的金屬表面上，有效減少“蒸汽罩”的產(chǎn)生，提高了凍存效果。Santos等[26]、 Carvalho等[34]的研究也報(bào)道了相似的結(jié)論。Wang 等[35]提出NIV方法，以針灸針作為冷凍載體穿刺卵巢組織，直接浸入液氮凍存，這種凍存方法能最大程度減少冷凍降溫過(guò)程中保護(hù)劑的用量，提高降溫速率，凍融后獲得較好的移植效果。亦有學(xué)者采用NIV法，使用更低濃度的冷凍保護(hù)劑獲得較好的冷凍效果[36]。

3 存在的問(wèn)題

目前卵巢的玻璃化冷凍尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的冷凍方法和冷凍液配置方案[37]，最佳的冷凍方法和冷凍液配置方案應(yīng)對(duì)卵巢組織的前處理、冷凍保護(hù)液濃度及種類(lèi)、冷凍平衡時(shí)間方法、冷凍載體的選擇等方面綜合考慮，盡可能減少細(xì)胞的物理?yè)p傷，降低細(xì)胞的化學(xué)毒性，保證凍存卵巢的組織活性，提高凍融后卵泡的存活率。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者不斷嘗試新的冷凍方法，其凍存效果取得了一定的進(jìn)展。尤其開(kāi)放載體的應(yīng)用有很多報(bào)道，在獲得更快的降溫速率的同時(shí)，由于卵巢組織直接與液氮接觸，存在被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)卵巢組織的安全應(yīng)用有一定的影響。

但隨著低溫生物學(xué)和生殖生物學(xué)的不斷發(fā)展，在新方法、新材料的方面的不斷探索嘗試，卵巢組織冷凍保存技術(shù)一定會(huì)日趨完善，為更安全、更高效地保存實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源，推動(dòng)生命科學(xué)基礎(chǔ)研究及新藥研發(fā)的更快發(fā)展提供有力保障。

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