鄰苯二甲酸酯類毒理學(xué)效應(yīng)及其機制研究進(jìn)展

李 蕾，宋乃寧，李海山，艾文超，陳會明

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院國家質(zhì)檢總局進(jìn)口化學(xué)品研究所，北京 100123)

鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters，PAE)又稱鈦酸酯，是1，2－苯二甲酸的酯類復(fù)合物質(zhì)的統(tǒng)稱，主要用途作為增塑劑添加至高分子聚合物中增加材料的柔韌性。PAE主要品種繁多，根據(jù)分子量大小分為以下2種:低分子量的鄰苯二甲酸二丁酯(di－butyl phthalate，DBP)和鄰苯二甲酸丁基芐基(benzyl butyl phthalate，BBP)多用于個人護理產(chǎn)品，如香水、護理液及化妝品［1－2］;而高分子量PAE，例如鄰苯二甲酸二乙基己基酯〔di－(2－ethylhexyl)phthalate，DEHP〕、鄰苯二甲酸二異壬酯(di－iso－nonyl phthalate，DINP)和鄰苯二甲酸二丁酯(di－n－butyl phthalate，DnBP)則通常添加于地板膠、墻漆和醫(yī)療器械［3－4］等消費品中，用以增加塑料材料的柔韌性。PAE具有基本相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但各個物質(zhì)顯現(xiàn)獨特的物理及化學(xué)性質(zhì)。目前研究者已確定不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的酯類物質(zhì)具有特異的毒性，但還未闡明具體的機制。人類主要通過食管、皮膚接觸及呼吸道暴露于PAE，低分子量的PAE可通過呼吸和皮膚進(jìn)入人體，而高分子量物質(zhì)則主要以食管和呼吸道作為主要暴露途徑。大部分PAE在人體內(nèi)代謝經(jīng)過2個階段［5］，首先水解為初級代謝物，即鄰苯二甲酸單酯，并在尿苷5'－二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下與葡萄糖醛酸反應(yīng)生成各自的葡糖醛酸結(jié)合物。作為PAE體內(nèi)生物標(biāo)志物的鄰苯二甲酸單酯生物活性增高，比母體化合物具有更高的毒性［6］。目前的動物毒理研究顯示，PAE及其代謝產(chǎn)物涉及的毒性終點包括發(fā)育毒性［7－8］、生殖毒性［9－10］、免疫毒性［11－12］和肝毒性［13］，最新報道顯示其與乳腺癌［14］以及卵巢癌［15］有密切聯(lián)系。本文針對PAE物質(zhì)的暴露途徑及其在體內(nèi)毒理學(xué)效應(yīng)及機制進(jìn)行綜述。

1 暴露途徑

1.1 注射暴露

對醫(yī)療器械及血袋中遷移的PAE物質(zhì)研究起始于20世紀(jì)70年代［16］，研究證實，醫(yī)用材料中的DEHP通過與藥品的接觸使患者暴露，最終暴露濃度與所用藥品有關(guān)，此類暴露具有特定的群體，長期暴露者包括透析、血友病和糖尿病患者。有研究證實，聚氰乙烯(polyvinyl chloride，PVC)儲存袋與藥品在24～26℃接觸4 h后，利用氣相色譜的氫火焰離子化檢測器可檢測到DEHP，且在12 h濃度達(dá)到最高值［17］。

1.2 經(jīng)口暴露

經(jīng)口暴露于污染的水源、食物以及食物容器是人體染毒最常見的途徑，兒童是此種暴露受害的特殊人群。由于PAE與高分子材料的結(jié)合并不緊密，因此，兒童在用嘴接觸PVC產(chǎn)品后，體內(nèi)PAE物質(zhì)水平顯著增高。Babich等［18］根據(jù)歐洲、加拿大、日本和美國對于軟塑料玩具中DINP的研究報告綜述了其對于兒童暴露的危害程度。研究采用新的DINP遷移速率測量方式，綜合考慮兒童口部運動活動和兒童年齡因素，最終得出如下結(jié)論:42%的檢測樣品中存在DINP，12～23月齡兒童是最大的暴露群體，平均暴露量為每天0.08 mg·kg－1。

1.3 經(jīng)皮暴露

鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)與DnBP分別廣泛存在于香水與指甲油中，研究者調(diào)查了2003年5月到2006年7月紐約市186名孕婦個人護理產(chǎn)品使用情況［19］，檢測分析孕婦尿樣中存在代謝單酯2－甲基－D－赤藻糖醇－4－磷酸和鄰苯二甲酸正丁酯，結(jié)果顯示，使用香水是DEP暴露的重要來源。

1.4 吸入暴露

PAE物質(zhì)大量添加于建筑材料及消費品中，是普遍存在的環(huán)境污染物。對瑞典斯德哥爾摩家庭環(huán)境、托兒所及工作環(huán)境的11種有機磷酯類和6種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)濃度檢測表明，上述物質(zhì)存在于所有的取樣地點，PAE分布更廣泛，且兩者濃度相差近10 倍［20］。

2 毒理學(xué)效應(yīng)及其機制

目前，PAE對人類健康的潛在危害研究集中在利用體內(nèi)及動物實驗研究該類物質(zhì)與人類健康終點可能的聯(lián)系，及其所可能產(chǎn)生的生理學(xué)后果。目前，PAE物質(zhì)危害機制研究重點是其對核受體家族的影響，及后續(xù)因氧化損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，上述影響與個體器官病變及人體肥胖糖尿病等疾病息息相關(guān)。

2.1 生殖及發(fā)育毒性

PAE具有類雌激素效應(yīng)，在體內(nèi)外實驗及動物模型中都表現(xiàn)抗雄激素作用，可影響個體內(nèi)分泌及生殖系統(tǒng)發(fā)育，并具有明顯的性別差異。動物實驗證實，產(chǎn)前及發(fā)育早期暴露于PAE的雄性動物生殖道會出現(xiàn)尿道下裂、隱睪癥、隱睪和肛門生殖器距離縮短等癥狀，統(tǒng)稱睪丸發(fā)育不全綜合征。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，PAE通過影響間質(zhì)細(xì)胞的睪酮生成，減少胰島素樣因子3表達(dá)而引發(fā)一系列的癥狀。

Wu等［21］的實驗結(jié)果顯示，小鼠每天暴露DEHP 500 mg·kg－1后，睪酮與胰島素樣因子3減少是一系列睪丸發(fā)育不全綜合征癥狀出現(xiàn)的關(guān)鍵，且甲基化程度和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平在受孕19 d與出生后3 d顯著增加。所以，DNA甲基化可能在睪丸畸形中發(fā)揮重要作用。DNA的甲基化狀態(tài)對染色體的結(jié)構(gòu)維持、X染色體失活、基因印記以及胚胎發(fā)育、正常細(xì)胞功能的維持，乃至疾病的發(fā)生是十分重要的。在胚胎期，基因組范圍的DNA甲基化模式異常會導(dǎo)致胚胎致死，而在成體中，異常的甲基化則意味著疾病，特別是腫瘤的發(fā)生。但在人類胎兒睪丸細(xì)胞體外實驗中，暴露于任何劑量的鄰苯二甲酸單乙基己基酯〔mono－(2－ethylhexyl)phthalate，MEHP〕其睪酮及黃體生成激素刺激類睪酮水平都無變化，不會引起Sertoli細(xì)胞的增殖及凋亡，但減少了抗穆氏管激素mRNA的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的凋亡減少其數(shù)量［22］。所以推測PAE在小鼠和人類中利用不同的機制影響雄性生殖系統(tǒng)，其生殖系統(tǒng)毒性具有種屬及年齡依賴性，可能由于胎兒和青春期生殖器官比成人要敏感的緣故。

PAE物質(zhì)的生殖毒性還表現(xiàn)為對睪丸及生精細(xì)胞的損害作用，干擾生精細(xì)胞與Sertoli細(xì)胞間的相互作用。DBP抑制睪丸Sertoli細(xì)胞中雄激素結(jié)合蛋白和抑制素的mRNA表達(dá)量，MEHP則通過抑制Sertoli細(xì)胞組織金屬蛋白酶抑制物－2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP2)水平，激活生精上皮基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)發(fā)揮作用。MEHP可阻止CCAAT增強子與CEBPA蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)的結(jié)合，從而抑制 TIMP 2基因表達(dá)［23］。

2.2 肝毒性

毒理學(xué)中對動物肝過氧化物酶體體積、數(shù)量及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptor，PPAR)的變化判斷外源物的肝毒性，PAE作為過氧化物酶體激活劑(peroxisome proliferator，PP)對PPAR具有激活效應(yīng)，導(dǎo)致過氧化物酶體體積和數(shù)量的增加會導(dǎo)致肝腫大或肝癌，其誘導(dǎo)DNA低甲基化也已確認(rèn)為產(chǎn)生肝毒性的機制之一。

通常認(rèn)為嚙齒類動物中PP通過影響核受體PPARα改變基因轉(zhuǎn)錄從而影響肝細(xì)胞發(fā)育導(dǎo)致癌癥。對F344大鼠進(jìn)行的為期26周的口服鄰苯二甲酸二己酯(dihexyl phthalate，DHP)實驗，再一次驗證了 PAE對 PPAR的激活作用［24］。給藥組F344大鼠肝重量明顯減輕，病理學(xué)觀察顯示，肝細(xì)胞肥大，且血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平下降。研究表明，DHP誘導(dǎo)肝癌前期細(xì)胞損失，是具有遺傳毒性的大鼠肝癌致癌物。但最近研究發(fā)現(xiàn)，DEHP在PPARα缺失的小鼠中也增加其肝癌疾病的發(fā)生，所以推測PP可能依賴其他的核受體影響轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，而并非只依賴PPARα引發(fā)多重核受體的轉(zhuǎn)錄途徑［25］。

在人類和實驗動物腫瘤研究中，基因組的低甲基化在腫瘤前期發(fā)生中發(fā)揮重要作用，DNA的甲基化水平和組蛋白修飾程度已經(jīng)成為腫瘤早期檢測的敏感性指標(biāo)。Wistar雄大鼠經(jīng)口暴露于DBP后，可降低肝細(xì)胞原癌基因c-myc的甲基化程度［26］，但也證實此變化與DNA復(fù)制和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性無關(guān)。

無論通過何種途徑作用，PAE物質(zhì)對大小鼠的肝致癌性已經(jīng)有很充足的數(shù)據(jù)支撐，在過去的十幾年中，包括亞慢性，亞急性和急性相關(guān)的實驗都揭示了PAE物質(zhì)的作用機制［27］_______激活PPARα及調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子。最近動物模型及轉(zhuǎn)基因鼠系也作為研究對象加入到機制研究中，動物模型及人類暴露于環(huán)境中PAE的研究數(shù)據(jù)顯示，嚙齒動物及人體癌的誘導(dǎo)產(chǎn)生是幾類肝細(xì)胞多重分子信號及通路交叉作用的結(jié)果，并且證實PAE的作用靶器官不僅只有肝。國際腫瘤研究機構(gòu)認(rèn)為，PAE對人類癌癥相關(guān)靶器官是肝和睪丸，但暴露于PAE與人類肝癌相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查研究很少。

2.3 免疫毒性

PAE 物質(zhì)具有免疫佐劑性質(zhì)［28－29］，其機制研究應(yīng)包括免疫細(xì)胞的基因表達(dá)及通過細(xì)胞機制調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［30］。研究證明，BBP不存在佐劑作用，但是其代謝物苯甲醇可引發(fā)明顯的免疫抑制［31］。免疫抑制是免疫毒理學(xué)研究的主要領(lǐng)域，很多研究致力于闡明化學(xué)物和藥物引起單方面或多方面免疫應(yīng)答能力降低的可能性。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系B4G12體外暴露于DBP，BBP和DEHP后，細(xì)胞繁殖能力降低，暴露于DBP的B4G12炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL－1β)，IL－8 和 IL－6 分泌增加，基因表達(dá)水平也升高［32］。另外巨噬細(xì)胞THP－1細(xì)胞暴露于DEHP 200 μmol·L－13 h后，分別利用ELISA和DNA微陣及RT－PCR分析檢測基因表達(dá)及免疫相關(guān)因子、趨化因子的改變情況發(fā)現(xiàn)，IL－8，CXCL1，CXCL2， CXCL3， CXCL6， CCL3， MMP3，MMP10，MMP14，集落刺激因子2(colony stimulating factor 2，CSF2)mRNA，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，NF－α)，IL－1β 和 IL－6 mRNA表達(dá)水平都明顯升高［33］，某些與中性粒細(xì)胞積聚有關(guān)的炎癥和呼吸系統(tǒng)疾病局部或血清中IL－8水平往往升高，如胃炎、炎癥性結(jié)腸炎、慢性支氣管炎等。不同濃度的DBP對巨噬細(xì)胞的吞噬能力均有影響［34］，可顯著降低表面清道夫受體CD36的表達(dá)，引發(fā)免疫抑制。先天性或獲得性免疫缺陷與微生物感染密切相關(guān)，所以對病原微生物抵抗力的破壞是免疫抑制的一個顯著特征，常見的感染部位為呼吸道感染、消化道感染、及中樞神經(jīng)系統(tǒng)及表皮炎癥。免疫抑制與腫瘤的產(chǎn)生也有密切關(guān)系，人類隨著年齡增長胸腺逐步萎縮，胸腺素水平下降，腫瘤產(chǎn)生率也隨之上升。

PAE除與免疫抑制相關(guān)外，還可引起超敏反應(yīng)。一般認(rèn)為Th2可介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)可最終導(dǎo)致過敏性皮炎及哮喘，而胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)公認(rèn)為Th2反應(yīng)的調(diào)控因子，在異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)誘導(dǎo)接觸性變態(tài)反應(yīng)模型評估TSLP作用的實驗中，發(fā)現(xiàn)DBP致敏導(dǎo)致TSLP水平升高，F(xiàn)ITC半抗原與其他溶劑并無此作用。因此，在FITC誘導(dǎo)的接觸性過敏反應(yīng)模型中，DBP對TSLP水平的上調(diào)作用是該模型成功構(gòu)建的重要因素，并可能同時引發(fā)Th2型反應(yīng)［35］。在小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中，DEHP 與 DINP 可刺激產(chǎn)生 IL－4［36－37］，在大鼠血細(xì)胞中，DEHP可明顯增加CD11b的表達(dá)，并專司炎癥細(xì)胞從血管至炎癥部位的遷移與附著［38］，PAE還可直接作用于呼吸道上皮細(xì)胞引發(fā)哮喘。

2.4 腫瘤及致癌性

PAE的基因毒性研究及其相關(guān)的毒性數(shù)據(jù)相當(dāng)廣泛復(fù)雜，且有很多的實驗?zāi)Ｐ?。其毒性表現(xiàn)包括DNA損傷、染色體相關(guān)損傷及影響、增加癌癥發(fā)生概率和細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)，及對核受體及基因表達(dá)的影響等。

DEHP對雌雄大小鼠肝癌的作用有充足的數(shù)據(jù)支持［39－40］，除了肝，還有其對潛在靶器官的致癌毒性的報道。雄性大鼠暴露于DEHP可引發(fā)腺泡細(xì)胞腺瘤，增加Leydig細(xì)胞腫瘤發(fā)生率，具有劑量依賴性［41］，雌性大鼠暴露則增加患乳腺癌、卵巢癌與肝毒細(xì)胞瘤的風(fēng)險［42－43］。

引發(fā)癌癥的機制研究涉及動物實驗與人體試驗，研究證明，DEHP暴露量低于可引發(fā)細(xì)胞毒性時，對DNA就已造成損傷。體外實驗發(fā)現(xiàn)，DEHP 1 ～10 g·L－1和 MEHP 30 g·L－1彗星試驗結(jié)果均為陽性，但此濃度的物質(zhì)并未具有細(xì)胞毒性［44－45］。DEHP在人體組織中可增加染色體畸變的概率，增加多倍體的產(chǎn)生，改變有絲分裂的速率［46－47］。人體細(xì)胞組織實驗顯示，DEHP可影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖，增加腫瘤細(xì)胞系中腫瘤的活動侵襲及擴散，并激活很多特定的核受體。

通過BBP對乳腺癌腫瘤生成過程的研究，確認(rèn)BBP通過誘導(dǎo)淋巴增強因子1的過表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生。而在卵巢癌細(xì)胞系BG－1中，證實在DBP可導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快，暴露6 h后可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D和CDK－4，表明其可損傷內(nèi)分泌系統(tǒng)，刺激雌激素陽性腫瘤細(xì)胞的繁殖［15］。而對于肝腫瘤，許多實驗證實與PAE物質(zhì)的PPARα，β和γ核受體激活物活性有關(guān)。DEHP代謝物MEHP可激活小鼠PPARα和PPARγ，但其本身對 PPARβ并無激活活性［48－49］。PPAR核受體在不同種類動物肝中表達(dá)有差異，其中大小鼠肝中PPARα表達(dá)水平較高，而人類則較低，所以目前還未有研究證實PAE物質(zhì)對人類肝中PPARα有激活作用。根據(jù)目前的研究結(jié)果，肝腫瘤與PAE物質(zhì)的聯(lián)系只限于大小鼠嚙齒動物種屬，其與人類肝癌的關(guān)系無論是基礎(chǔ)研究還是流行病學(xué)都還未有明確證據(jù)［50－51］。

3 展望

盡管PAE作為商業(yè)用途已經(jīng)廣泛使用了超過50年，但其關(guān)于人類健康暴露相關(guān)的研究還不充分。PAE種類繁多，分子結(jié)構(gòu)存在差異，理化性質(zhì)更是復(fù)雜，其毒理學(xué)效應(yīng)與實驗種屬、靶器官的敏感性及染毒方式有密切的聯(lián)系。另外，PAE進(jìn)入人體后的代謝過程也對研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，代謝產(chǎn)生的單酯比母體化合物具有更高的生物活性，其毒理學(xué)效應(yīng)也是研究的重點。以上因素也給研究帶來了不小的難度，目前的PAE暴露于健康終點研究中的限制主要集中在以下幾點:① 分析方法的準(zhǔn)確性、敏感性對結(jié)果的影響;② 受試人群數(shù)量不足;③PAE物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)過代謝后單酯物質(zhì)定性定量及毒理學(xué)效應(yīng)研究［52－54］。

根據(jù)以上所了解的PAE的研究限制及毒性相關(guān)的綜合背景，建議今后的研究方向從物質(zhì)暴露方式開始系統(tǒng)研究。確定不同的暴露方式對人體的危害，物質(zhì)進(jìn)入人體后側(cè)重母體化合物水解物與人體健康的聯(lián)系，包括暴露后所涉及的分子通路研究。具體研究包括高分子鏈PAE體內(nèi)生物標(biāo)志物的篩選，長鏈水解單酯在體內(nèi)的作用，其對DNA鏈的損傷作用，其引發(fā)疾病的機制研究，以及相關(guān)的流行病學(xué)研究。另外因為環(huán)境中PAE并非單一存在，研究也應(yīng)涉及PAE混合物的范疇，且其與其他內(nèi)分泌干擾物相互協(xié)作所產(chǎn)生的影響也在研究范圍之內(nèi)。

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