布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白TcpB的研究進展

雷霜霜，鐘志軍，彭廣能

布魯氏菌病(brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種可累及全身多個系統(tǒng)并有潛在致命危險的動物源性傳染病，主要依靠受感染動物以及受污染動物產(chǎn)品進行傳播。人和動物感染后主要呈現(xiàn)流產(chǎn)、不孕、空懷、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。布病在世界各地廣泛流行，全球每年因布病造成的經(jīng)濟損失近50億美元[1]。布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，其基因組中無質(zhì)粒，僅有大小不同的兩條染色體，胞內(nèi)生存與復(fù)制是布魯氏菌主要的毒力特征[2]。一直以來，布魯氏菌獨特的致病機制是研究的重點和熱點。

病原菌通過其毒力蛋白以多種方式破壞宿主先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，其中重要的方式之一便是通過接頭蛋白(adaptor protein)作用于宿主重要信號通路中的關(guān)鍵分子，如含TIR結(jié)構(gòu)域蛋白(Toll/IL-1 receptor-like domain-containing protein)。目前，研究已發(fā)現(xiàn)多種病原菌含有TIR結(jié)構(gòu)域蛋白，如Salmonellaserovar[3]、uropathogenicEscherichiacoli(UPEC)[4]、Staphylococcusaureus[5]、Yersiniapestis[6]等。布魯氏菌能分泌TIR結(jié)構(gòu)域TcpB(TIR domain-containing protein inBrucella)，它又被稱為Btp1(BrucellaTIR domain containing protein)[3,7]，至少在羊種布魯氏菌(Brucellamelitenis)、牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)和綿羊附睪種布魯氏菌(Brucellaovis) 3種布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)存在TcpB。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TcpB作為1個重要的毒力因子，在逃避宿主免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，可減少樹突狀細胞活化，并抑制其活性，并且抑制促炎細胞因子分泌，在調(diào)節(jié)微管組裝動力學(xué)方面也有顯著作用[9]。

1 布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白

1.1TIR結(jié)構(gòu)域的組成特征 TIR結(jié)構(gòu)域首先在真核生物中發(fā)現(xiàn)，其中包括非常重要的TLRs(Toll Like receptors)，均以TIR結(jié)構(gòu)域為其重要特征之一。真核和原核生物中的TIR結(jié)構(gòu)域通常包含150～200個氨基酸殘基，其序列可分為3部分，包括：5個α螺旋、5個β折疊以及連接它們的8個柔性肽段[3]。所有TIR結(jié)構(gòu)域有共同的序列基序：box1(F/ Y)-DAFISY、box2(GYKLC-RD-PG)和box3(1個保守的W由堿性殘基包圍的部分)，其中box1和box2對于蛋白的功能至關(guān)重要，而box2的BB循環(huán)是TIR結(jié)構(gòu)域功能最重要的區(qū)域[10]。定點誘變研究表明，BB循環(huán)中一些殘基是TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。TIR結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)高度保守，但也存在一些構(gòu)象差異，TLR1與TLR2中的TIR結(jié)構(gòu)域序列同源性為50%[15]。TIR結(jié)構(gòu)域位于蛋白的C-末端或N-末端區(qū)域，其余區(qū)域高度可變。這種結(jié)構(gòu)的多樣性對于介導(dǎo)不同的信號通路起著關(guān)鍵作用[11]。

1.2細菌中的TIR結(jié)構(gòu)域蛋白 生物信息學(xué)分析表明，922種致病性和非致病性細菌中包含TIR結(jié)構(gòu)[12]。在金黃色葡萄球菌，馬爾他布魯氏桿菌和沙門氏菌腸炎血清型等大范圍的細菌中，Newman等鑒定出200多種TIR類似結(jié)構(gòu)[3]。生物物理特性分子模擬實驗初步表明細菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白與TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上存在很高的同源性[7]。細菌TIR蛋白大約含230-310個氨基酸，其中保守部分占150-200個氨基酸。TIR結(jié)構(gòu)域的重要功能是介導(dǎo)與含TIR結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)合，細菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白大多作用于宿主TLR信號通路中含TIR結(jié)構(gòu)域的TLR受體(TLR1-13)以及其下游的5個接頭蛋白MyD88、MAL、TRIF、TRAM和SARM[13]。來源于沙門氏菌腸炎型的tlpA 蛋白( TIR-like protein A)，該蛋白能夠抑制哺乳動物TIR結(jié)構(gòu)域蛋白的能力，如Toll樣受體，IL-1受體，反式激活MyD88以及NF-κB的DNA結(jié)合活性，從而下調(diào)TIR信號通路[3]。TIR結(jié)構(gòu)域蛋白C(TcpC)在常見的人類腎盂腎炎大腸桿菌中得到鑒定，Snydera等在結(jié)構(gòu)上證明TcpC與MyD88和TLR4結(jié)合，通過其DD和BB循環(huán)損害TLR誘導(dǎo)的細胞因子[4]。數(shù)據(jù)庫顯示在金黃色葡萄球菌MSSA476中存在編碼類似人TIR結(jié)構(gòu)域的基因，被命名為金黃色葡萄球菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白(TirS)。Askarian等在人胚胎腎細胞，巨噬細胞和角質(zhì)形成細胞的細胞系中異位表達TirS，發(fā)現(xiàn)其干擾TLR2信號，包括MyD88和TIRAP，NF-κB以及有絲分裂原活化蛋白激酶途徑[5]。Tdps在高致病性細菌鼠疫耶爾森氏菌(YpTdp)中鑒定出來，Rana等通過表達一些不同長度的YpTIR，對TIR結(jié)構(gòu)域進行了生物物理特性和功能分析[6]。

1.3布魯氏菌TcpB的結(jié)構(gòu)特征 Snyder等對TcpB晶體結(jié)構(gòu)做了一些探討Radhakrishnan等對TcpB生物活性和功能方面也做了相關(guān)研究[14,17]。Kaplan-Türk?z等在3.15?分辨率下觀察到TcpB的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TcpB的晶體結(jié)構(gòu)中有一個獨特的α尾巴環(huán)繞兩個TIR結(jié)構(gòu)域的二聚物[15]。這種相互作用第一次在TIR結(jié)構(gòu)域中觀察到，加強了AB二聚體生理學(xué)相關(guān)的假設(shè)。它表明全長的TcpB二聚體是不對稱的，即N-末端域可能彼此相互作用獨立形成功能單元。由于N-末端形成螺旋線圈，連接1個α尾巴與TIR結(jié)構(gòu)域形成的環(huán)顯得非常靈活，所以在溶液中不同全長蛋白二聚體也可能存在。布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域TcpB 蛋白的結(jié)構(gòu)顯示與PdTIR最相似而DE環(huán)是更類似哺乳動物MyD88和TIRAP[15]。

2 布魯氏菌TcpB的功能

2.1抑制樹突細胞活化 樹突細胞(Dendritic cells，DC)是介導(dǎo)病原體識別的典型代表，有從外周組織到次級淋巴器官的遷移能力，引起原發(fā)性T細胞反應(yīng)。DC能表達多種病原體識別受體如C-型凝集素和Toll樣受體(TLRs)，識別分子模式，決定免疫反應(yīng)類型。然而，一些細菌病原體能破壞DC的功能，從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測。很多研究使用巨噬細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞作為布魯氏菌感染模型，但最新研究表明，布魯氏菌能在人單核細胞源性DC中復(fù)制，DC可構(gòu)成一個重要的細胞內(nèi)環(huán)境以促進感染[9,16]。在哺乳動物細胞中過表達TcpB，發(fā)現(xiàn)DC出現(xiàn)皺縮，變圓等變化[18]。

大多數(shù)病原體可在淋巴結(jié)濾泡區(qū)域或固有層中相鄰的絨毛區(qū)觀察到，而布魯氏菌以一種類似在巨噬細胞和非吞噬細胞內(nèi)進行體外培養(yǎng)的方式，建立一個DC內(nèi)復(fù)制環(huán)境。研究表明，細菌感染的DC通常與它們活化和成熟表型相關(guān)聯(lián)。成熟的DC可以通過細胞表面的MHCII級分子，微管收集中心(MTOC)周圍大量聚集的多泡體(MVB)以及一種新合成的泛素化蛋白質(zhì)大胞樹突狀細胞形成聚集小狀感應(yīng)結(jié)構(gòu)(DALIS)來表征[11]。沙門氏菌感染的DC很好地證明了這種情況，MHC II級分子大多定位在細胞表面和MVBs大量聚集在MTOC。但大多數(shù)布魯氏菌感染的DC并沒有顯示任何成熟跡象，因為布魯氏菌軸承細胞很少顯示溶酶體集群，MHCII級分子細胞表面很少積累。盡管DALIS的功能尚不清楚，使用FK2抗體能很容易檢測識別單個泛素化的蛋白質(zhì)，為監(jiān)測DC的成熟提供了一種有效的方法。布魯氏菌感染DALIS的平均數(shù)量遠小于在沙門氏菌中形成的DALIS。這些結(jié)果說明布魯氏菌在DC中復(fù)制可能限制DC的成熟過程。Salcedo等在感染的早期，用小鼠腸道循環(huán)模型來表征布魯氏菌在胞內(nèi)的靶點，發(fā)現(xiàn)DC是布魯氏菌早期感染時胞內(nèi)一個潛在的細胞靶標(biāo)。采用小鼠骨髓源樹突狀細胞(DC培養(yǎng)上清)作為模型，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌在DC細胞中復(fù)制，抑制DC的成熟過程，最終導(dǎo)致細胞因子TNF-a,IL-12 (p40/p70), IL-6以及IFN-b 分泌減少，從而影響抗原的遞呈和抗原遞呈細胞的數(shù)量[8]。

2.2抑制NF-κB信號通路 核因子κB(NF-κB)是1種廣泛存在于真核細胞內(nèi)基因多向性轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel家族，1986年首次在小鼠B淋巴細胞的核抽提物中發(fā)現(xiàn)，NF-κB/Rel家族成員N端都含1個高度保守的，由300個氨基酸組成的Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain,RHD)。大部分NF-κB二聚體為轉(zhuǎn)錄激活因子，是免疫激活必不可少的信號。然而，細菌病原體通過進化以直接干預(yù)或模仿宿主細胞信號蛋白，從而有利于在宿主內(nèi)持續(xù)性感染。Cirl等發(fā)現(xiàn)布魯氏菌編碼的結(jié)構(gòu)域蛋白TcpB能有效抑制由TLR2，TLR4介導(dǎo)的NF-κB的激活和促炎性細胞因子的分泌[7]。Radhakrishnan等采用濃度遞增的MBP-TcpB聚合物以及單獨使用MBP孵化巨噬細胞，誘導(dǎo)后NF-kB的活性引起IkB磷酸化，進而導(dǎo)致它們解離，發(fā)出降解信號，誘導(dǎo)基因表達。IκBa刺激細胞降解表明NF-κB的激活，內(nèi)化的MBP-TcpB能夠抑制IκBa的解離，IκBa能抑制NF-kB的活性，從而證明了TcpB損害TLR2，TLR4介導(dǎo)的NF-κB的活性[17]。此外，TcpB序列分析顯示，TcpB與銜接分子TIRAP存在中等水平相似度，后續(xù)實驗證明TcpB能與質(zhì)膜和微管共定位，通過其N-末端結(jié)構(gòu)域磷酸肌醇作用于TIRAP來抑制NF-kB的活性[17]。TcpB可能內(nèi)化后由布魯氏菌囊泡分泌，穿越囊泡膜轉(zhuǎn)移到TLR信號通路靶蛋白上抑制NF-kB的活性。

2.3抑制微管的組裝 微管參與細胞多方面應(yīng)答，包括細胞分裂，遷移和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。微管網(wǎng)是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分和組裝途徑，微管的穩(wěn)定性直接影響細胞多種信號傳導(dǎo)過程[17]。亞細胞定位研究表明，TcpB大部分定位于質(zhì)膜和微管。研究發(fā)現(xiàn)TcpB誘導(dǎo)微管增厚，TcpB修飾的微管表現(xiàn)出耐抗腫瘤藥諾考達唑誘導(dǎo)的解聚作用[18]。研究證明TcpB需要1個完整的TIR結(jié)構(gòu)域微管網(wǎng)才能抑制TLR信號通路，維持其正?；钚?。BB循環(huán)是1個次級TIR結(jié)構(gòu)域，TLR與銜接分子之間相互作用的蛋白質(zhì)。維持微管穩(wěn)定特性區(qū)域位于TcpB的BB循環(huán)，包含124-176氨基酸，同時這部分也是抑制TLR不可缺少的。缺失BB循環(huán)突變株，TcpB微管結(jié)合以及微管穩(wěn)定能力都減弱。Radhakrishnan等采用免疫熒光法以及共同沉淀測定法，體外進行微管結(jié)合實驗，進一步確定TcpB與微管的相互作用，發(fā)現(xiàn)MBP-TcpB能與微管結(jié)合，由于MBP本身不存在與微管任何親和力能力，說明該微管結(jié)合能力是由TcpB融合蛋白產(chǎn)生的[18]。多數(shù)MBP-TcpB存在于含微管結(jié)合的小碎片中，表明微管與TcpB之間存在重要的相互影響。

紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，可降低聚合微管蛋白的臨界濃度，提高聚合穩(wěn)定微管的能力。Xiao等實驗表明，TcpB與紫杉醇具有相似的性質(zhì)[19]。類似于紫杉醇，TcpB加速微管的成核和生長階段的形成和穩(wěn)定微管，能夠抵抗低溫誘導(dǎo)微管的解離，證明TcpB具有高效的穩(wěn)定微管的性質(zhì)。TcpB與微管相互作用以及微管穩(wěn)定特性的生物學(xué)意義目前還不明確，可能是TcpB誘導(dǎo)微管沿著微管軌道聚集進而干預(yù)囊泡運輸，從而有利于布魯氏菌逃脫吞噬體-溶酶體融合以及吞噬體查殺。

3 TcpB作用的分子機制

3.1與MyD88的作用 病原體采用多種機制逃避宿主的免疫反應(yīng)。由TcpB介導(dǎo)的免疫逃避機制尚未完全闡明，TcpB在宿主中的靶點也存在爭議。值得注意的是，TcpB類似MAL/TIRAP的功能，結(jié)合質(zhì)膜通過N-氨基PIP2(磷脂酰肌醇4,5 -二磷酸)從而影響MyD88的功能[18]。Cirl和他的同事研究證明，在HEK293細胞中TcpB與內(nèi)生性MyD88相互作用[3]。Weiss等研究表明，對于受感染宿主MyD88是宿主清除布魯氏菌至關(guān)重要的[20]。最近，有報道表明能與TcpB免疫共沉淀，轉(zhuǎn)染的是TIRAP，而非MyD88[21]。Cabantous等用基于綠色熒光蛋白和Gaussia熒光素酶蛋白質(zhì)片段互補測定(PCAs)法，探測到與TcpB直接相互作用只有MyD88與TIRAP，且與MyD88的相互作用強于TIRAP[22]。此外，TcpB-MyD88的相互作用不阻止MyD88同型二聚體化，但需要下游激活I(lǐng)RAK激酶[23]。除了羧基末端TIR域，MyD88還含有1個氨基端死亡域DD。TcpB能作用于MyD88 DD從而破壞MyD88DD以及MyD88DD與MyD88TIR之間的信號傳遞。研究結(jié)果表明，MyD88 DD和TIR結(jié)構(gòu)域未開放的接口可調(diào)節(jié)MyD88的活性，病原體可能針對這個接口逃避先天免疫。宿主接頭蛋白MyD88直接干擾布魯氏菌蛋白質(zhì)TcpB取決于DD中的MyD88，而不是TIR結(jié)構(gòu)域，TcpB抑制這種相互作用以及單獨DD的自我相互作用，但TcpB不抑制全長的MyD88二聚體。早期的酵母雙雜交實驗中，發(fā)現(xiàn)MyD88DD和TIR結(jié)構(gòu)域存在新的相互作用，單獨的MyD88TIR結(jié)構(gòu)域能結(jié)合到全長MyD88，而非單獨的DD[20,23]。然而，在含有這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊的小蛋白質(zhì)中，它極有可能存在由兩個結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)的接口。在MyD88DD和TIR結(jié)構(gòu)域之間分子內(nèi)的相互作用，可以起到調(diào)節(jié)MyD88結(jié)合功能，這種相互作用通過TcpB表現(xiàn)出功能上的意義需要進一步闡明。在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)全長的MyD88或MyD88DD過表達能增強NF-κB的活性，但TcpB本身抑制NF-κB的活性[22]。全長的MyD88和MyD88TIR都不能通過TcpB解除對NF-κB抑制，而DD卻有顯著作用。從生物化學(xué)上角度思考，這些結(jié)果提供了關(guān)于TcpB與MyD88相互作用的機制很好的見解。

3.2與MAL的相互作用 近來已經(jīng)證實，MAL包含1個N-末端磷酸肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域，允許其從胞質(zhì)外招募MyD88，在質(zhì)膜上靶向接近TLR2和TLR4。抑制細胞因子-1(SOCS-1，一種E3泛素連接酶)可通過負向MAL的降解信號調(diào)節(jié)TLR2和TLR4泛素依賴過程[24]。Lavigne等人為了測試TcpB是否能增強泛素依賴過程從而降解MAL，在蛋白酶體抑制劑MG132存在和不存在兩種情況下，表達HA-MAL，TcpB，和VSV-泛素。發(fā)現(xiàn)表達的MAL自身泛素化在一個較低的水平，但在TcpB存在的情況下，泛素化程度大大增加。這表明，磷酸化形式的MAL被TcpB泛素化降解。然而，不像SOCS-1，TcpB沒有與已知泛素連接酶存在明顯相似性[25]。因此，目前還不清楚TcpB本身是否能增強泛素化MAL，還是它能招募一些其他泛素連接酶，所以TcpB本身能否通過泛素化引起MAL降解，相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域仍有待確定。

要確定在感染布魯氏菌的哺乳動物細胞中TcpB是否對MAL水平有影響，Sengupta等進一步評估了此蛋白在小鼠巨噬細胞樣細胞系的水平(J774感染強毒布魯氏菌株2308和等位基因TcpB缺失突變體指定為KB2)[21,24]。相比之下，感染流產(chǎn)布魯氏菌比感染KB2顯示MAL的水平顯著下降，這些結(jié)果進一步證明TcpB導(dǎo)致MAL的降解。重組布魯氏菌TcpB表達在哺乳動物的活性細胞中，發(fā)現(xiàn)MAL的活性明顯受到影響。通過降解MAL，TcpB減少可用磷酸化MAL的量，從而減弱信號，但沒有完全關(guān)閉信號系統(tǒng)。在小鼠巨噬細胞系，沒有檢測磷酸化形式的MAL，TcpB可以簡單地通過降解它們減少可MAL的量來發(fā)揮同樣的效果。Sengupta等研究結(jié)果卻與Cirl等的研究不一致，他們提出TcpB只干擾 MAL/TIRAP而不干擾TcpB-MAL/TIRAP相互作用。同樣，在HEK293細胞中，TcpB 減少MAL/TIRAP表達，增強MAL/TIRAP泛素化和降解[22]。

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