美洲型和歐洲型PRRSV RT-PCR鑒別檢測方法的建立

戴光文，謝麗華＊，江精華，李 媚，梁 真，蘇志毅，嚴(yán) 紅

（1.梧州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西梧州543002；2.梧州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西梧州543002）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，又稱豬藍(lán)耳?。┦怯韶i繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性傳染病，以母豬繁殖障礙、仔豬高病死率、發(fā)熱、藍(lán)耳、呼吸困難為特征。該病于1987年首次在美國報(bào)道［1］，此后世界各地均有發(fā)生。歐美先后分離到病原，分別被鑒定為歐洲型和美洲型兩種基因型。我國在1996年首次分離到美洲型PRRSV［2］，迄今國內(nèi)以該型毒株流行為主。2006年在我國南方高熱豬群中發(fā)現(xiàn)美洲型PRRSV NSP2基因發(fā)生缺失變異［3］，形成具有高致病性的毒株，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。當(dāng)前我國豬群同時(shí)遭受美洲型PRRSV 高致病性毒株和經(jīng)典毒株的侵害［4］，兩種毒株引起的豬群癥狀和病變幾乎相同，難以從臨床上進(jìn)行區(qū)分，逐一進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定存在耗時(shí)過長、浪費(fèi)試劑等缺點(diǎn)。本研究旨在建立可以同時(shí)檢測美洲型PRRSV 高致病性和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別方法，并以此開展豬藍(lán)耳病的快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 總RNA 提取試劑盒和DNA Marker（TIANGEN）；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、重組核酸酶抑制劑、TaqDNA 聚合酶和dNTP Mix（Invitrogen）；核酸染料GelRed（Biotium）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RT-PCR檢測試劑盒（北京世紀(jì)元亨），用于比較試驗(yàn)。

1.1.2 儀器設(shè)備 PCR 儀、高速冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)（珠海黑馬公司）；電泳儀槽（君意JY600C）、微量移液器（芬蘭Beta）、二級(jí)生物安全柜（BHC-1300ⅡA2）等。

1.1.3 參照物 變異株TJM-F92、經(jīng)典株CH-1R活疫苗（每頭份不少于105.0TCID50）分別用于PRRSV 兩種毒株的陽性對(duì)照。豬瘟（細(xì)胞源）、豬偽狂犬?。℉B-98株）、豬乙型腦炎（SA14-14-2株）、豬傳染性腹瀉-豬流行性腹瀉-輪狀病毒三聯(lián)活疫苗用于特異性試驗(yàn)。

1.1.4 樣品來源 10份豬血清（編號(hào)X1～X10）采自散養(yǎng)戶臨床無癥狀豬，6份豬組織（編號(hào)Z1～Z6）為屠宰場豬有病變的肺、脾、淋巴結(jié)混樣。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 登陸的美洲型PRRSV TJ株（登錄號(hào)EU860248）、CH-1a株（登錄號(hào)AY032626）及其他毒株核苷酸全序列，綜合利用Primer 5.0和Oligo 6生物軟件分析，設(shè)計(jì)一對(duì)可以同時(shí)擴(kuò)增變異毒株和經(jīng)典毒株NSP2基因的特異性共有引物（位于NSP2不連續(xù)缺失90個(gè)核苷酸位點(diǎn)兩端，上游引物P1：5′-TCCACCAAGAGTTCAACCT-3′，下 游 引 物P2：5′-GACGCAGACAAATCCAGAG-3′），預(yù)期擴(kuò)增基因片段分別為342bp（變異毒株）和432bp（經(jīng)典毒株）。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 抽提和RT-PCR 取稀釋后的活疫苗或臨床樣品上清液200μL，按照總RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄酶說明書提取RNA 和進(jìn)行RT。對(duì)PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終確定為10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（50mmol／L）0.75μL，上、下游引物（10 μmol／L）和dNTP Mix（10 mmol／L）各0.5μL，DNA 聚合酶（5U／μL）0.2μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，加滅菌水至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 配制新鮮的1×TAE 電泳液和12g／L瓊脂糖凝膠（經(jīng)GelRed染色），每孔加入PCR 產(chǎn)物8μL，電壓8V／cm，室溫25℃，電泳后拍照。

1.2.4 特異性、敏感性、重復(fù)性和比較試驗(yàn) 利用滅菌生理鹽水將豬瘟、豬偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬傳染性腹瀉-豬流行性腹瀉-輪狀病毒等活疫苗稀釋后作為待檢樣品進(jìn)行RT-PCR 特異性試驗(yàn)。將TJM-F92株、CH-1R 株 活 疫 苗 按 照101、102、103、104、105、106倍連續(xù)稀釋后進(jìn)行RT-PCR 敏感性擴(kuò)增。用本研究方法對(duì)10份臨床樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，并與商品化試劑盒檢測比較。

1.2.5 臨床應(yīng)用 對(duì)臨床16份樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR建立及特異性試驗(yàn)結(jié)果

CH-1R、TJM-F92均擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段（即432bp和342bp），陰性對(duì)照、豬瘟、豬偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬傳染性腹瀉、豬流行性腹瀉、輪狀病毒沒有擴(kuò)增出條帶（圖1）。

圖1 RT-PCR 特異性檢測Fig.1 RT-PCR specificity assay

圖2 變異株敏感性試驗(yàn)Fig.2 The sensitivity test of the variant strain

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

反應(yīng)體系能擴(kuò)增出105倍稀釋的變異株模板（圖2）和104倍稀釋的經(jīng)典株模板（圖3），可以檢測出低至101TCID50的病毒感染量。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)及與商品化試劑盒比較結(jié)果

圖3 經(jīng)典株敏感性試驗(yàn)Fig.3 The sensitivity test of the classic strain

對(duì)豬血清（X6～X10）和豬組織（Z1～Z5）利用本法重復(fù)3次檢測，樣品X9、Z1、Z4、Z5為PRRS變異株陽性，其他樣品為陰性，3次結(jié)果無差異。利用商品化豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RT-PCR檢測試劑盒檢測，陽性出現(xiàn)278 bp，結(jié)果與研究建立的方法符合率100%（圖4）。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

從散養(yǎng)戶和屠宰場16份樣品中檢測出經(jīng)典株陽性1份（圖5血清X2），變異株陽性5份（圖5血清X9；圖6 組 織Z1、Z4～Z6），總體陽性率為37.5%，變異株占總毒株數(shù)的83.3%。

圖4 商品化試劑盒檢測結(jié)果Fig.4 Detection results by commercial kit

圖5 豬血清檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of pig sera

圖6 豬組織檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of pig tissues

3 討論

PRRSV 診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［5］、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）［6］、血清病毒中和試驗(yàn)（SVN）［7］、直接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）［8］、病毒分離鑒定［9］、核酸序列測定［10］、針對(duì)單一PRRSV 毒株的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）［11］等。前3 種方法常用于抗體檢測，不能區(qū)分免疫抗體和野毒感染抗體。IFA、病毒分離鑒定、核酸序列測定可以準(zhǔn)確地對(duì)病原做出鑒定，但耗費(fèi)較長時(shí)間，不適合快速診斷。常規(guī)非鑒別性RTPCR 方法雖然快速，但是無法同時(shí)檢測變異株和經(jīng)典株感染。本研究利用美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株相對(duì)于經(jīng)典株在NSP2基因上不連續(xù)缺失90個(gè)核苷酸的標(biāo)志特征，設(shè)計(jì)特異性共有引物，可以同時(shí)快速對(duì)2種毒株進(jìn)行鑒別檢測。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)相差90bp 的2 個(gè)較大分子量片段（500bp以上）很難用肉眼分辨，因此本研究設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段（432bp和342bp）在標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量400bp條帶附近，電泳后用肉眼清晰辨別，不用測序即可快速鑒別。

試驗(yàn)表明本研究建立的方法具有良好特異性、敏感性、重復(fù)性和可靠性，只能擴(kuò)增出美洲型PRRSV 基因，豬群當(dāng)中常見的CSFV、PRV、JEV、TGEV、PEDV、RV 等病毒不會(huì)干擾結(jié)果，可擴(kuò)增出低至101TCID50的病毒感染量，可以與國內(nèi)優(yōu)秀商品化試劑盒媲美。該法需要注意，1孔DNA Marker最多給予6個(gè)樣品提供參照，否則電泳斜度可能造成分辨誤差。在電泳過程中要控制電壓溫度，并且使用新配置的電泳液和凝膠才能跑出良好效果。

臨床上從豬血清、豬組織中都可以檢測出PRRSV，表明建立的方法可以用于活體豬常規(guī)監(jiān)測，也可以用于病死豬鑒定檢測。豬血清陽性率（2／10）低于豬組織陽性率（4／6），這與PRRSV 侵入機(jī)制、細(xì)胞受體和體內(nèi)分布有關(guān)［12-13］。PRRSV 主要侵害含有巨噬細(xì)胞的器官如肺臟、淋巴結(jié)等，在肺臟中含量高且維持時(shí)間長，在血液中含量稍低且維持時(shí)間短。變異株所占總毒株的83.3%，表明當(dāng)前豬群主要以高致病性變異毒株流行為主，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［14-16］。通過檢測發(fā)現(xiàn)，屠宰場和散養(yǎng)戶都是豬藍(lán)耳病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，要加強(qiáng)監(jiān)控。

［1］Keffaber K K.Reproductive failure of unknown etiology［J］.Swine Pract，1989，18（31）：1-9.

［2］郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS 流產(chǎn)胎兒分離PRRSV 的研究［J］.中國畜禽傳染病，1996，22（2）：1-5.

［3］Tian K，Yu X，Zhao T，et al.Emergence of fatal PRRSV variants：Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark［J］.PLoS One，2007，2（6）：e526.

［4］范培虎，危艷武，郭龍軍，等.2005-2010 年我國部分地區(qū)PRRSV 流行毒株的遺傳變異分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（3）：1-7.

［5］陳進(jìn)會(huì)，賴維莉，顏其貴.重組M 蛋白間接ELISA 檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011，28（4）：53-54.

［6］譚 斌，劉長明，危艷武，等.PRRSV-IPMA 抗體檢測試劑盒的研制及其應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（11）：25-29.

［7］冷超糧，安同慶，陳家锃，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白B表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（4）：297-300.

［8］米立娟，呂宗吉，馬春全，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒直接免疫熒光檢測方法的建立［J］.中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013，21（1）：42-47.

［9］楊德康，王桂軍，李 郁，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41（5）：78-80.

［10］施開創(chuàng)，林昌華，張步嫻，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GX1003株全基因序列測定與分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（2）：30-36.

［11］何世成，鄒 敏，劉道新，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（7）：10-13.

［12］張奕強(qiáng)，劉文倩，劉永生，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒侵入介體的研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（3）：109-114.

［13］方桂友，王隆柏，莊向生，等.變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒在人工感染豬體內(nèi)分布情況［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（3）：5-10.

［14］張玉德，王光祥，吳錦艷，等.2007-2010年間我國西北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（10）：1081-1088.

［15］劉沫飛，李 蕾，鄭 輝，等.2010-2011年我國五省PRRSV分離株ORF5基因遺傳變異分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：6-11.

［16］趙日浪，施開創(chuàng)，林昌華，等.廣西區(qū)2008-2011年豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因的遺傳變異分析［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（8）：784-790.