重復(fù)序列突變與神經(jīng)退行性疾病

宿俊杰， 靳 玫， 劉曉利， 唐超智， 賈盼盼綜述， 王文晟審校

核苷酸重復(fù)序列普遍存在于真核生物基因組。在染色體上經(jīng)常出現(xiàn)一些重復(fù)序列，如(CCG)n、(CCTG)n等。相比一般DNA序列，這些重復(fù)序列更不穩(wěn)定。其拷貝數(shù)易增加或減少，導(dǎo)致重復(fù)序列擴展或縮減［1，2］。重復(fù)序列在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等過程中易形成二級結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)序列的變異，進而導(dǎo)致人類神經(jīng)退行性疾病。神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease，NDDs)是一種以大腦和脊髓細(xì)胞神經(jīng)元喪失的為特征的疾病。隨著人口老齡化的發(fā)展，NDDs將超過癌癥，成為繼心血管疾病之后的第二大死亡原因。在神經(jīng)退行性疾病中，有約40種是由重復(fù)序列的突變引起的。本文對重復(fù)序列不穩(wěn)定的特征、機制及其與NNDs的相關(guān)性進行綜述。

1 與重復(fù)序列突變相關(guān)的神經(jīng)性退行疾病

重復(fù)序列突變是一種獨特的變異，它和近40種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。不像其他變異，重復(fù)序列的變異是動態(tài)的。引起各種NNDs的重復(fù)序列的類型、相關(guān)基因及位置等。

2 重復(fù)序列突變的機制

正確理解引發(fā)疾病的重復(fù)序列變異的機制對開辟新的治療途徑和研發(fā)新藥物至關(guān)重要。由于重復(fù)序列的特殊性，易形成非正常DNA二級結(jié)構(gòu)。正常情況下，這些非正常的二級結(jié)構(gòu)在DNA代謝過程中被清除掉，然而當(dāng)清除過程異常時，就引起重復(fù)序列突變［1，2］。

2.1 重復(fù)序列的結(jié)構(gòu) 重復(fù)序列易形成的非正常二級結(jié)構(gòu)的特性與其對稱性，序列組成，超螺旋等方面的因素是密切相關(guān)的。雖然這些二級結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)無法探知，但在體外的實驗中許多已被證實。如(CCTG)n·(CAGG)n折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，(CCG)n·(CGG)n和(CGCG4CG4)n能折疊成G四鏈結(jié)構(gòu)，(CTG)n·(CAG)n能形成“十字”結(jié)構(gòu)，(GAA)n·(TTC)n在負(fù)超螺旋影響下能形成H-DNA。這些異常的DNA二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響DNA復(fù)制、修復(fù)、同源重組及轉(zhuǎn)錄等過程［3］。下面就重復(fù)序列形成的二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)序列的不穩(wěn)定機制進行解釋。

2.2 重復(fù)序列突變形成的分子機制 對于重復(fù)序列是如何在DNA代謝過程中產(chǎn)生擴增或縮減的，有以下幾種機制。

2.2.1 DNA復(fù)制機制 在對酵母等的研究中發(fā)現(xiàn)許多參與DNA復(fù)制，特別是與岡崎片斷成熟過程中有關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生變異時引發(fā)急劇升高的重復(fù)序列的不穩(wěn)定。DNA復(fù)制模型又包括兩種假說。第一種是Harvey于1997年提出的“鏈滑動”假說［4］。該假說認(rèn)為，DNA復(fù)制過程中，含有不穩(wěn)定重復(fù)序列的DNA單鏈作為模板合成新鏈時，會由于鏈的滑動作用造成堿基錯配，若錯配引起新生鏈上形成泡狀或者發(fā)夾等結(jié)構(gòu)，該新生鏈作為模板鏈在下一輪復(fù)制時就會造成重復(fù)序列的擴增或縮減。近年，Mirkin提出在滯后鏈合成過程中復(fù)制叉的暫停與重新啟動假說，即在滯后鏈模板中，由重復(fù)序列形成的異常二級結(jié)構(gòu)會拖延滯后鏈的合成，破壞其與前導(dǎo)鏈合成的協(xié)調(diào)性［3］。該模型可以在分子水平上解釋一些重復(fù)序列擴展的遺傳特征。

2.2.2 DNA修復(fù)機制 許多DNA修復(fù)包含了部分DNA復(fù)制的過程，像FEN1、PCNA等DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)同樣也參與了DNA修復(fù)，因而在修復(fù)過程中，重復(fù)序列的DNA同樣會形成滑動鏈的結(jié)構(gòu)。另外，非有絲分裂的組織(如腦組織)或DNA修復(fù)缺陷的組織同樣出現(xiàn)大量的重復(fù)序列突變現(xiàn)象。因此DNA修復(fù)同樣也與穩(wěn)定重復(fù)序列突變發(fā)生的過程有關(guān)。根據(jù)DNA修復(fù)的類型，造成重復(fù)序列的不穩(wěn)定的原因可以從以下4個方面進行闡述。(1)錯配修復(fù):在轉(zhuǎn)基因老鼠中，CAG/CTG的擴展離不開錯配修復(fù)蛋白質(zhì)MSH2、MSH3和PMS2的功能。MSH2的變異導(dǎo)致重復(fù)序列的擴展停止。而MSH3的失活使CTG/CAG重復(fù)序列發(fā)生縮減，這為 CTG/CAG 疾病的治療提供了新思路［5～7］。(2)堿基切除修復(fù)(BER):研究發(fā)現(xiàn)HD和FXS小鼠氧化促進三核酸重復(fù)序列的擴展，雙氧水處理可誘導(dǎo)人的HD細(xì)胞的重復(fù)序列擴展，這些結(jié)果暗示重復(fù)序列的擴展是在堿基切除修復(fù)(BER)這一過程中產(chǎn)生的，另外，失去氧化堿基切除修復(fù)酶-8-鳥嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)功能的小鼠抑制重復(fù)序列擴展的發(fā)生的事實也支持了這一觀點［8，9］。在去除氧化堿基后，BER是通過部分DNA合成完成的。這一過程和岡崎片斷的成熟類似，產(chǎn)生的含重復(fù)序列的單鏈Flap會形成發(fā)卡和環(huán)狀中間物阻止FEN1切除重復(fù)的Flap，導(dǎo)致 DNA的擴展［10］。(3)核酸切除修復(fù)(NER):NER包括兩條途徑:轉(zhuǎn)錄耦合修復(fù)和全球基因組修復(fù)。ERCC1-XPF復(fù)合物切斷先于XPG，含有重復(fù)序列的單鏈DNA形成發(fā)卡或環(huán)狀的Flap，阻止了XPG的切除，導(dǎo)致重復(fù)序列突變［2］。在不同的研究中，CAG重復(fù)序列傾向于縮減。在人的細(xì)胞中，基因敲除NER的蛋白質(zhì)ERCC1，XPG和CSB時CAG重復(fù)序列的縮減程度降低［11］。(4)雙鍵斷裂修復(fù)(DSBR):研究表明雙鍵斷裂和重復(fù)序列相關(guān)的復(fù)制異常有關(guān)。復(fù)制中產(chǎn)生的鏈滑動和復(fù)制叉暫停會產(chǎn)生雙鍵斷裂，最終通過基因交換和單鏈DNA結(jié)合來修復(fù)。具體將在DNA重組模型中加以闡述。

目前，DNA幾種修復(fù)途徑之間的交聯(lián)與寡核苷酸重復(fù)擴展之間的關(guān)系越來越引起人們的關(guān)注，并且，現(xiàn)在有證據(jù)傾向于認(rèn)為混合途徑更為重要的［12］。比如MSH2-MSH6、BER糖基化酶和MUTYH形成結(jié)構(gòu)復(fù)合體，以及上述的MSH2-MSH3和OGG1之間的關(guān)系來解釋BER和MMR與寡核苷酸重復(fù)序列長度變化的關(guān)系。

2.3 DNA重組機制 基因重組也參與了重復(fù)序列突變的發(fā)生過程。最簡單的一種機制是減數(shù)分裂過程中同源染色體上的重復(fù)運行之間的不平等交換導(dǎo)致擴展和縮減。重組修復(fù)模式認(rèn)為DNA重組和DNA合成過程聯(lián)合，可以導(dǎo)致三核苷酸重復(fù)序列突變擴展。研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列擴展可促進自身不平等的姐妹染色單體交換，并且基因轉(zhuǎn)換期間經(jīng)歷了頻繁的擴展［13］。另一種機制是在DNA修復(fù)過程中形成的單鏈DNA入侵雙鏈中的同源序列引起重復(fù)序列擴展。在滯后鏈模板中，通過一個可擴展的重復(fù)導(dǎo)致復(fù)制叉的拖延而形成一個穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，由真核細(xì)胞內(nèi)切酶切割和加工這種結(jié)構(gòu)，這個內(nèi)切酶和細(xì)菌核酸酶SbcCD功能同源，會產(chǎn)生一個3’端重復(fù)序列擴展的單鏈DNA片段，能侵入姊妹染色單體，導(dǎo)致重復(fù)序列擴展［3］。

3 重復(fù)序列突變導(dǎo)致NDDs的機制

3.1 疾病相關(guān)基因功能的改變 重復(fù)序列擴展導(dǎo)致的突變發(fā)生在編碼區(qū)時，比如由多谷氨酰胺殘基polyQ片段介導(dǎo)的多聚谷氨酰胺病中，編碼蛋白的谷氨酰胺鏈延長，導(dǎo)致該蛋白在細(xì)胞內(nèi)累積，對神經(jīng)元產(chǎn)生了某種毒性。目前已經(jīng)證明，polyQ長度的增加對細(xì)胞核具有毒性，是導(dǎo)致疾病發(fā)生的一個重要因素［14］。此外，異常擴展的polyQ突變蛋白可能與一種或幾種神經(jīng)元中大量表達的易損傷的蛋白發(fā)生相互作用，導(dǎo)致選擇性神經(jīng)元核內(nèi)包涵體的形成和神經(jīng)元變性。近年的研究發(fā)現(xiàn)，大量表達于SCA1患者Purkinje細(xì)胞和其它腦區(qū)的富含亮氨酸的酸性核蛋白就是一種在損傷的神經(jīng)元中大量表達的蛋白［15］。再者，在HD和SCA1轉(zhuǎn)基因鼠模型以及HD患者的神經(jīng)元中均發(fā)現(xiàn)含有擴增的polyQ的細(xì)胞核內(nèi)包涵體［16］，由此推測這些核內(nèi)包涵體可導(dǎo)致神經(jīng)性失調(diào)或功能障礙。

3.2 異常RNA的產(chǎn)生 DM、FRAXA和FRAXE等疾病的三核苷酸重復(fù)擴展位于其致病基因的非翻譯區(qū)。在DM2中，其(CCTG)n擴增的重復(fù)片段被轉(zhuǎn)錄為RNA后，突變的RNA會滯留在核內(nèi)，干擾肌核的正常功能，對肌纖維產(chǎn)生毒性［17］。其它可能有類似病理機制的疾病還有SCA8、SCA10、SCA12以及HDL2。

3.3 基因功能的丟失 通過阻斷或阻礙基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致基因功能的丟失也會導(dǎo)致NNDs。比如，進行性肌陣攣癲癇(EPM1)是由于半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(cystatin B)基因轉(zhuǎn)錄起始點上游啟動子中的重復(fù)序列(C4GC4GCG)n發(fā)生擴展，阻斷轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄功能喪失而引起的。

3.4 表觀遺傳學(xué)修飾 研究發(fā)現(xiàn)，SCA2致病基因ATXN2啟動子區(qū)域CpG的DNA甲基化水平與患者(CAG)n的擴展有關(guān)［18］。另外，F(xiàn)RDA患者致病基因fxn位點的核小體核心組蛋白H3的第9位賴氨酸殘基大多處于甲基化修飾狀態(tài)，說明FRDA患者細(xì)胞內(nèi)FXN蛋白的編碼基因所在的染色質(zhì)部位是處于抑制狀態(tài)，這樣的染色質(zhì)狀態(tài)可能影響轉(zhuǎn)錄的延伸［19］。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙酰化與去乙?；^程處于動態(tài)平衡，Debacker等發(fā)現(xiàn)特殊的HDAC在出芽酵母和人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中均能促進(CTG)n的擴增［20］。

4 總結(jié)與展望

過去的研究對重復(fù)序列突變的機制的理解已有很大提高。給由此引起的神經(jīng)性退行疾病的治療帶來了希望。如抑制MSH3的活性可使重復(fù)序列縮減同時不造成整個染色體的不穩(wěn)定和發(fā)癌的現(xiàn)象。本研究小組發(fā)現(xiàn)利用解旋酶，可消除DNA復(fù)制或修復(fù)中重復(fù)序列產(chǎn)生的發(fā)卡或泡狀結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)，阻止重復(fù)序列的擴展。通過特定目標(biāo)假尿苷化實現(xiàn)翻譯終止。使擴展的重復(fù)序列在翻譯時提前中止，產(chǎn)生正常的產(chǎn)物。研究同時也顯示出重復(fù)序列突變的復(fù)雜性。部分原因在于重復(fù)序列的突變不是單一機制完成的，而是多種DNA代謝過程疊加的結(jié)果。另外變異的發(fā)生對于不同的階段，組織和細(xì)胞而言是獨特的。只有把隱藏的由重復(fù)序列突變引起的神經(jīng)退化性疾病的致病機制逐步理清，才能針對神經(jīng)退化性疾病加以有效的預(yù)防、早期診斷和治療。因此從基礎(chǔ)研究到開發(fā)出對重復(fù)序列變異引發(fā)的神經(jīng)性退行疾病有效的發(fā)治療方法還有相當(dāng)?shù)穆芬摺?/p>

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