固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖化學成分研究△

陳曉梅，楊峻山，郭順星，孟志霞

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193)

專 題

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09301002-001-031)

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郭順星，研究員，博士生導師，研究方向：珍稀瀕危藥用植物菌根生物學；Tel：(010)62829619，E-mail：sxguo1986@163.com

固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖化學成分研究△

陳曉梅，楊峻山，郭順星*，孟志霞

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的研究固體培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖的化學成分。方法利用硅膠、葡聚糖凝膠柱色譜法，分離化學成分，根據理化性質和MS、NMR等技術對化合物進行結構鑒定。結果從固體培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖甲醇提取物中分離鑒定了8個化合物，分別為：3-羥基-24-亞甲基-環(huán)羊毛脂烷(1)，3，5-二羥基-24-甲基-環(huán)羊毛脂烷(2)，3，5-二羥基-環(huán)羊毛脂烷(3)，β-谷甾醇(4)，豆甾醇(5)，N-阿魏?；野?6)，反式對羥基桂皮酸(7)和阿魏酸(8)。結論化合物1,2,3和6均為首次從石斛屬植物中分離得到。

鐵皮石斛原球莖；固體培養(yǎng)；化學成分

蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是中藥鐵皮石斛的唯一來源植物。鐵皮石斛生長緩慢，自然繁殖率低，加之人為的過度采挖和對其生境的破壞，導致鐵皮石斛的野生資源已經瀕臨枯竭。人工栽培生產是目前鐵皮石斛相關保健品及藥品所使用的原料藥的主要來源。原球莖(protocorm)是種子萌發(fā)時種胚吸水膨大，突破種皮后形成的球形原胚。鐵皮石斛原球莖是利用種子人工繁育生產種苗的起點，具有增殖率高，生長周期短，能夠實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產的特點[1-2]。HPLC-MS指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的主要化學成分與藥材的基本相同，但相同成分之間的含量差別較大[3]。藥理學研究表明，鐵皮石斛原球莖與鐵皮石斛藥材均具有提高機體免疫功能的作用，且二者的作用強度相似[4]；鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1具有抗腫瘤和抗氧化作用[5-6]。這些研究結果顯示了鐵皮石斛原球莖替代或部分替代原植物成為一種新資源的潛力。

液體懸浮培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的小分子化學成分已有報道[7]。本文報道了固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖化學成分的研究，從中分離鑒定了8個化合物，分別為：3-羥基-24-亞甲基-環(huán)羊毛脂烷(1)，3，5-二羥基-24-甲基-環(huán)羊毛脂烷(2)，3，5-二羥基-環(huán)羊毛脂烷(3)，β-谷甾醇(4)，豆甾醇(5)，N-阿魏?；野?6)，反式對羥基桂皮酸(7)和阿魏酸(8)。除β-谷甾醇外，以上化學成分均與液體培養(yǎng)原球莖的成分不同，其中化合物1,2,3和6為首次從石斛屬植物中分離得到。

1 材料與儀器

固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖，培養(yǎng)基組成為：MS培養(yǎng)基大量元素減半，土豆200 g·L-1，煮20 min，取汁，蔗糖30 g·L-1，肌醇100 mg·L-1，pH 5.8，瓊脂粉7.5 g·L-1。培養(yǎng)條件為溫度24～26 ℃，光照強度1500 Lx，光照時間10 h·d-1。原球莖培養(yǎng)18周后收獲，去除培養(yǎng)基，于50～55 ℃干燥后使用。

熔點由X-4型顯微熔點儀測定(溫度計未校正)；IR由Perkin-Elmer 983G 型紅外光譜儀測定；MS由VG ZAB-2F型質譜儀測定；NMR由Bruker AM-500型核磁共振儀測定，TMS為內標。柱色譜用硅膠(100～200目、200～300目)、硅膠H，薄層色譜用硅膠G、GF254，均為青島海洋化工廠產品。提取分離用試劑均為分析純。

2 提取與分離

取鐵皮石斛原球莖干燥材料800 g，甲醇回流提取3次，濃縮提取液，得到提取浸膏350 g。提取浸膏以蒸餾水分散，分別以石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各部分萃取浸膏65，15，36 g。取石油醚萃取浸膏10 g，以硅膠柱色譜，石油醚-丙酮梯度洗脫，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫部分共得到31個組分(Fr.1～Fr.31)。組分Fr.14經過硅膠柱色譜，石油醚-三氯甲烷(50∶1)洗脫，得到化合物1(600 mg)、2(15 mg)和3(10 mg)。組分Fr.25經硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脫，得到化合物4(75 mg)和5(67 mg)。乙酸乙酯萃取浸膏經過硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫；三氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫部分再經過硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇-水(20∶1∶0.02)洗脫，共得到28個組分(Fr.1～Fr.28)。組分Fr.1～12合并后經Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，得到化合物8(8 mg)；組分Fr.17～22合并后經Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，得到化合物6(100 mg)和7(15 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：白色針簇狀結晶(甲醇)，mp 121～122 ℃。Liebermann-Burchard反應陽性。EI-MSm/z：440[M]+，425，422，407，397，379，315，297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.33(1H，d，J=3.5 Hz，19-Ha)，0.56(1H，d，J=3.5 Hz，19-Hb)，0.81(3H，s，29-CH3)，0.90(3H，s，30-CH3)，0.89(3H，d，J=4.5 Hz，21-CH3)，0.97(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.02(3H，d，J=6.5 Hz，27-CH3)，1.03(3H，d，J=7.0 Hz，26-CH3)，3.28(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)，4.66(1H，s，31-Hb)，4.71(1H，s，31-Ha)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：156.9(C-24)，105.9(C-31)，78.8(C-3)，52.3(C-17)，48.8(C-14)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.5(C-4)，36.1(C-20)，35.6(C-12)，33.8(C-25)，32.9(C-15)，32.0(C-1)，31.3(C-23)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，28.3(C-21)，28.1(C-7)，26.5(C-16)，26.04(C-10)，26.00(C-11)，25.4(C-28)，22.0(C-27)，21.9(C-26)，21.12(C-22)，21.11(C-6)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.0(C-18)，14.0(C-29)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[8]，鑒定為3-羥基-24-亞甲基-環(huán)羊毛脂烷(cyclolanostane-3-ol,24-methylene)。

化合物2：白色針狀結晶(甲醇)，mp 176～177 ℃。Liebermann-Burchard反應陽性。EI-MSm/z：458[M]+，443，440，425，422，407，397，379，353，318，315，和297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.32(1H，d，J=4.0 Hz，19-Ha)，0.54(1H，d，J=4.0 Hz，19-Hb)，0.80(3H，s，29-CH3)，0.87(3H，d，J=5.0 Hz，21-CH3)，0.89(6H，s，27-CH3，30-CH3)，0.91(3H，d，J=7.0 Hz，31-CH3)，0.96(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.07(3H，s，26-CH3)，3.28(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：78.8(C-3)，74.8(C-25)，52.2(C-17)，48.8(C-14)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.7(C-4)，36.54(C-24)，36.50(C-20)，35.5(C-12)，32.9(C-15)，31.9(C-1)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，29.4(C-23)，28.1(C-7)，26.4(C-16)，26.05(C-10)，26.01(C-11)，25.4(C-28)，23.4(C-26)，21.12(C-6)，21.10(C-22)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.4(C-21)，18.0(C-18)，17.5(C-27)，16.9(C-31)，14.0(C-29)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[8]，鑒定為3，25-二羥基-24-甲基-環(huán)羊毛脂烷(cyclolanostane-3,25-diol,24-methyl)。

化合物3：白色針狀結晶(甲醇)，mp 183～184 ℃。Liebermann-Burchard反應陽性。EI-MSm/z：444[M]+，426，411，408，393，315，297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.36(1H，d，J=4.0 Hz，19-Ha)，0.58(1H，d，J=4.0 Hz，19-Hb)，0.80(3H，s，29-CH3)，0.88(3H，d，J=6.5 Hz，21-CH3)，0.91(3H，s，30-CH3)，0.96(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.21(6H，s，26-CH3，27-CH3)，3.30(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：78.8(C-3)，71.1(C-25)，52.4(C-17)，48.8(C-14)，48.4(C-24)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.5(C-4)，36.1(C-20)，35.6(C-12)，32.9(C-15)，32.0(C-1)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，29.3(C-27)，29.2(C-26)，28.2(C-7)，26.7(C-23)，26.5(C-16)，26.03(C-10)，26.00(C-11)，25.4(C-28)，21.12(C-6)，21.10(C-22)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.3(C-21)，18.0(C-18)，14.0(C-29)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[8-9]，鑒定為3，25-二羥基-環(huán)羊毛脂烷(cyclolanostane-3,25-diol)。

化合物4：白色針狀結晶(甲醇)，mp 136～137 ℃。EI-MSm/z：414[M]+，399，396，329，273，255。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.55(1H，m)，5.37(1H，d，J=4.7 Hz)。以上譜學數據與文獻基本一致[10]，鑒定為β-谷甾醇。

化合物5：白色針狀結晶(丙酮)，mp.165～167°C。EI-MSm/z：412[M]+，397，394，369，351，271，255。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.55(1H，m)，5.17(1H，dd，J=15.1，8.64 Hz),5.04(1H，dd，J=15.1，8.71 Hz)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[11]，鑒定為豆甾醇。

化合物6：白色無定型粉末(甲醇)。EI-MSm/z：313[M]+，193，192，178，177，145，120，107。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.94(3H，s，OCH3)，6.19(1H，d，J=15.5 Hz，7-H)，6.83(2H，d，J=8.4 Hz，3′-H，5′-H)，6.92(1H，d，J=8.3 Hz，5-H)，7.00(1H，d，J=1.5 Hz，2-H)，7.07(1H，dd，J=8.3，1.5 Hz，6-H)，7.11(2H，d，J=8.4 Hz，2′-H，6′-H)，7.56(1H，d，J=15.5 Hz，8-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.74(7′-C)，40.91(8′-C)，55.91(OCH3)，109.53(6-C)，114.65(2-C)，115.52(2′-C，6′-C)，118.02(5-C)，122.15(7-C)，127.29(1′-C)，129.92(3′-C，5′-C)，130.80(1-C)，141.18(8-C)，146.63(3-C)，147.34(4-C)，154.34(4′-C)，166.19(C=O)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[12]，鑒定為N-阿魏?；野?N-feruloyltyramine)。

化合物7：白色針狀結晶(丙酮)，mp 211～213 ℃。EI-MSm/z：164[M]+，147，119，91，65。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，d，J=15.5 Hz，8-H)，6.80(2H，d，J=8.5 Hz，3-H，5-H)，7.44(2H，d，J=8.5 Hz，2-H，6-H)，7.59(1H，d，J=15.5 Hz，7-H)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[13]，鑒定為反式對羥基桂皮酸(trans-p-hydroxycinnamic acid)。

化合物8：白色粉末，mp 169～170 ℃。TLC溴酚蘭顯色為黃色斑點。EI-MSm/z：194[M]+，179，150，135，107。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.97(3H，s，-OCH3)，6.33(1H，d，J=15.9 Hz，8-H)，6.96(1H，d，J=8.2 Hz，5-H)，7.09(1H，d，J=1.7 Hz，2-H)，7.13(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，6-H)，7.74(1H，d，J=15.8 Hz，7-H)。以上譜學數據與文獻報道基本一致[14]，鑒定為阿魏酸(ferulic acid)。

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StudiesontheChemicalConstituentsofSolidCulturedDendrobiumofficinaleProtocorms

CHENXiaomei,YANGJunshan,GUOShunxing*,MENGZhixia

(InstituteofMedicinalPlantsDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)

Objective：To study the chemical constituents of solid culturedDendrobiumofficinaleprotocorms.MethodsThe chemical constituents were isolated using silica gel,Sephadex LH-20 column chromatography.ResultsEight compounds have been isolated form methanol extract of induced protocorms,and were identified as cyclolanostane-3-ol,24-methylene(1),cyclolanostane-3,25-diol-24-methyl(2),cyclolanostane-3,25-diol(3),β-sitosterol(4),stigmasterol(5),N-feruloyltyramine(6),trans-p-hydroxycinnamic acid(7)and ferulic acid(8).ConclusionCompounds1,2,3and6were isolated fromDendrobiumfor the first time.

Dendrobiumofficinaleprotocorms,Solid culture,Chemical constituents

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.001

2013-11-18)