星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選黃連的提取工藝△

趙文龍,周昌妮,王佳樂,歐麗婷,賈永艷

(河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

中藥工業(yè)

河南中醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新性學(xué)習(xí)項目(yxcx2012-1)

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賈永艷，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物制劑新技術(shù)與新劑型，E-mail：hnzyjyy@126.com

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選黃連的提取工藝△

趙文龍,周昌妮,王佳樂,歐麗婷,賈永艷*

(河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

目的優(yōu)選黃連的提取工藝。方法以總生物堿的含量為指標(biāo)，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法對乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時間進(jìn)行考察。結(jié)果最優(yōu)提取工藝為12倍量含80﹪乙醇回流提取3次，每次0.5 h。結(jié)論優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定可行，可用于黃連的提取。

黃連；星點設(shè)計；總生物堿；工藝優(yōu)選

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島素功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征，病程較長，并發(fā)癥多，難以根治。復(fù)方葛黃制劑由葛根、黃連等藥味組成，具有生津、瀉火、養(yǎng)陰清熱之功效，是治療糖尿病的臨床驗方。為提高藥物療效、延長藥物作用時間，現(xiàn)欲將其制成滲透泵片，筆者對方中黃連進(jìn)行了提取工藝研究。黃連為多年生草本毛茛科植物黃連、三角葉黃連、云連的干燥根莖，性寒,味苦,具有清熱燥濕,瀉火解毒功能[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃連中的主要有效成分是以鹽酸小檗堿為代表的生物堿類，其具有抗病原微生物、抗腹瀉、抗炎和免疫促進(jìn)以及降血壓、抗心律失常、降血糖等藥理作用，用于急性腸胃炎、口舌生瘡、燒燙傷、心率失常、高血壓、糖尿病等疾病的治療[2-3]。本研究采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法，以黃連總生物堿含量為指標(biāo)，對復(fù)方葛黃方劑中黃連的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

PIHW型調(diào)溫電熱套(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)；恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；METTLERAE240十萬分之一天平(德國梅特勒公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-250小型真空干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；UV-2201紫外分光光度儀(日本島津公司)。

鹽酸小檗堿對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-20091)；復(fù)方葛黃方劑(自制，批號：20121205，20121217，20121218，20121219)；黃連(購自河南中原正信藥材有限公司)，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定符合《中國藥典》2010版黃連項下要求；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃連總生物堿的測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品3.07 mg，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為122.8 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取相當(dāng)于1 g生藥的藥液，水浴蒸干，用蒸餾水溶解定容至25 mL。

2.1.3 吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液和對照品溶液各1.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋定容至刻度，以蒸餾水為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版附錄VA)，在200～700 nm進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長為346 nm。

2.1.4 測定方法 照2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋定容至刻度，以蒸餾水為空白，采用紫外分光光度法，在346 nm處測定吸光度，計算黃連總生物堿含量。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 分別精密量取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋并定容至刻度，測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：Y=0.061 8X-0.007 3，(r=0.999 9)，實驗表明，鹽酸小檗堿濃度在2.46～12.28 μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密量取同一批樣品(批號：20121205)5份，按2.1.4項下方法測定吸光度，計算樣品中黃連總生物堿含量，依次為14.87%，14.66%，14.74%，15.14%，14.79%，平均含量為14.84%，RSD=0.89%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液0.5 mL(鹽酸小檗堿含量：5.94 mg·mL-1)5份，分別置25 mL量瓶中，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.30 mg·mL-1)10.0 mL，按2.1.4項下方法測定吸光度，計算樣品中黃連總生物堿含量，計算回收率?；厥章室来螢?7.33%，98.21%，95.48%，96.67%，101.54%，平均回收率為97.85%，RSD=1.66%。

2.2 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

目前，在中藥提取工藝優(yōu)化研究中多采用正交設(shè)計、均勻試驗設(shè)計、星點設(shè)計等方法，其中星點設(shè)計通過多元非線性模型的擬合，能建立擬合度好、相關(guān)性高、預(yù)測性較好的回歸模型，同時結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法分析優(yōu)化工藝條件更加簡單、直觀[4]，為此，筆者采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法對黃連的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)單因素考察結(jié)果，以水為提取溶劑時，提取物中黃連總生物堿的含量為11.26%；以80%乙醇為提取溶劑時，黃連總生物堿的含量可達(dá)13.69%，結(jié)果表明，醇提效果明顯好于水提，故選用乙醇為提取溶劑。

以黃連總生物堿的含量為指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，其中提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，暫定為3次。每因素設(shè)5個水平，用代碼值-α，-1，0，1，+α表示(因素中心復(fù)合設(shè)計的α=1.732)[5-7]。因素水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 復(fù)方葛黃方劑中黃連提取星點設(shè)計試驗因素水平表

表2 復(fù)方葛黃方劑中黃連提取星點設(shè)計試驗安排及結(jié)果

續(xù)表2

表3 方差分析

以黃連總生物堿的含量為指標(biāo)，使用Minitab 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，該軟件對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了線性、兩因素相互作用、完全二次多項式模型擬合，得出的最佳擬合模型為完全二次多項擬合，其擬合方程及相應(yīng)r2值如下：

Y=-10.094 4+0.207 4X1+2.714 3X2+0.205 2X3-0.001 4X12-0.108 5X22-0.000 4X32+0.003 6X1X2-0.000 8X1X3-0.010 8X2X3,r2=0.939 8。

二次多項擬合模型的r2已經(jīng)達(dá)到了0.939 8，同時，由表3可知，對含量的方差分析，其線性、平方、以及交互項的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，回歸達(dá)到顯著水平，說明效應(yīng)值與各因素之間存在顯著的回歸關(guān)系。失擬項用來檢測回歸模型與實際實驗設(shè)計的擬合程度的好壞，如果失擬項顯著，說明對效應(yīng)值有影響的還有其他因素。失擬項P=0.079>0.05，失擬項不顯著，從而表明該模型能夠?qū)S連總生物堿的提取進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和分析[8]。

根據(jù)所擬合的回歸方程，作效應(yīng)曲面圖，考察所擬合的效應(yīng)曲面形狀，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量、提取時間對黃連總生物堿含量的影響。其等值線圖和效應(yīng)曲面圖如圖1～3。

圖1 含量與乙醇用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)的等值線圖及曲面圖

圖2 含量與提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的等值線圖及效應(yīng)面圖

圖3 含量與提取時間、乙醇用量的等值線圖及曲面圖

以上3組圖直觀地反映了各因素對效應(yīng)值的影響。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，乙醇用量為10倍量左右時，黃連總生物堿含量達(dá)到最大值，隨著醇用量增加和醇濃度的升高，黃連總生物堿含量呈下降趨勢。由圖2可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，黃連總生物堿含量先升高后逐漸降低，隨提取時間的延長含量變化不明顯。由圖3可知，隨醇用量的升高，黃連總生物堿含量逐漸升高，提取時間的延長對含量影響不明顯。

運(yùn)用Minitab軟件的效應(yīng)優(yōu)化器對實驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到模型的最優(yōu)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，乙醇用量為12倍量，提取時間為30 min，預(yù)測的黃連總生物堿含量為17.97%。

為驗證效應(yīng)面法分析結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件對黃連總生物堿提取實驗進(jìn)行3次重復(fù)驗證實驗，在此條件下，驗證實驗的黃連總生物堿平均含量為17.88%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.78%。說明建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測效果，優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方葛黃方劑中黃連提取工藝驗證實驗 /%

3 討論

黃連中的主要有效成分為小檗堿型總生物堿，小檗堿難溶于水，溶于熱水，故常用水、乙醇為溶劑提取黃連中的小檗堿。本實驗中對提取溶劑進(jìn)行簡單考察，表明適宜濃度的乙醇對黃連的提取率要高于水提取。黃連中總生物堿類含量較大，使用紫外可見分光光度法可對總生物堿含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，并且UV法較其他檢測方法簡單便捷。

星點設(shè)計-效應(yīng)面法相對于正交設(shè)計、均勻設(shè)計能夠擬合更加準(zhǔn)確的二次多項式擬合模型，模型的預(yù)測精度和準(zhǔn)確度相對較高，能夠為中藥的提取工藝優(yōu)化提供可靠依據(jù)，其在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來越廣泛。

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OptimizationofExtractionfromCoptidisRhizomabyCentralCompositeDesignandResponseSurfaceMethod

ZHAOWenlong,ZHOUChangni，WANGJiale，OLiting,JIAYongyan*

(Collegeofpharmacy,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：To optimize the extraction process of Coptidis Rhizoma.MethodsUsing central composite design and response surface method to investigate the Fufang Gehuang osmotic pump tablet extraction with ethanol concentration,dosage of ethanol,extraction time.ResultsThe optimal extraction process of Fufang Gehuang osmotic pump tablet is：12 times the amount of 80% ethanol,extracted three times,each time for 0.5 hours.ConclusionThe optimized process is stable and feasible,and can be used for extracting Fufang Gehuang osmotic pump tablet.

Coptidis Rhizoma;Central composite design;Total alkaloids;Process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.013

2013-09-13)