擬南芥RPS14基因的克隆表達及功能初步研究

范艷榮 劉瑩 張飛云

（首都師范大學生命科學學院，北京 100048）

核糖體是合成蛋白質(zhì)的重要細胞器，包括40S小亞基和60S大亞基。這些亞基分別有4種不同類型的RNA和80種結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)組成。RPS14（Ribosomal protein S14）是40S亞基的組成成分，這個蛋白屬于S11P核糖體蛋白家族［1］。根據(jù)已有研究，人類、酵母等真核生物體內(nèi)的RPS14基因主要負責RNA轉(zhuǎn)錄后加工，如SSU-rRNA（small subunit rRNA）的加工成熟與組裝，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯過程。在中國倉鼠的卵巢細胞中，該基因的突變能導致產(chǎn)生蛋白合成抑制劑，抵抗催吐劑的合成。

擬南芥腺苷酸激酶6（Arabidopsis thaliana Adenylate kinase 6，AAK6）是一種腺苷酸單磷酸激酶，廣泛存在于生物體中。AK6基因已在大多數(shù)動物，如人類、果蠅、線蟲以及酵母中有了較深入的研究，近年來人們開始探究AK6基因在植物體內(nèi)的特性與功能。以模式植物擬南芥為研究對象，已證實AK6蛋白具有腺苷酸激酶活性，能可逆地催化γ磷酸基團的轉(zhuǎn)移（通常作用于ATP），使ATP和AMP反應生成兩分子的ADP，以此來維持細胞內(nèi)的能量平衡［2-4］。同時，脊椎動物、果蠅、酵母菌，以及植物細胞核中存在一種亞核結(jié)構(gòu)柯浩體，它能夠行使mRNA和rRNA前體的拼接和剪接功能。在對人類AK6基因（HAK6/CBRF）的初步研究表明，AK6基因定位于柯浩體上，故又稱為柯浩體調(diào)節(jié)因子，其很可能在柯浩體上發(fā)揮重要作用，與真核細胞中核糖體的組裝相關(guān)［5，6］。通過前期的研究，從aak6-/aak6-突變體植株與野生型植株的生長狀況對比可以看出，突變體明顯矮?。?，7］。

RPS14基因參與RNA的轉(zhuǎn)錄后加工過程，推測其可能影響植株的生長狀況。本研究擬用體外pulldown技術(shù)，并結(jié)合SDS-PAGE和Western blot檢測，旨在探究擬南芥中RPS14蛋白與AK6蛋白是否存在相互作用，找到植株矮化的內(nèi)在線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 pEASY-T3、pGEX-6P-1載體、pET-28a載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α與TOP10、BL21（DE3）均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 Trizol試劑購自美國TEL-TEST Inc。常用化學無機鹽等試劑均為北化分析純試劑。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermerters公司。高保真PCR試劑盒、隨機引物購自上海生工生物工程公司。T-A cloning 試劑盒購自全式金公司。各種構(gòu)建載體所需工具酶（如限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等）購于TaKaRa公司。質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自QIN-GEN公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與檢測及反轉(zhuǎn)錄 以擬南芥的葉片為材料，用Trizol法提取RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 RPS14基因的擴增 根據(jù)GenBank中2g36160序列利用PrimerPremier5.0設計引物，上游EcoR I 酶切位點，下游加入Xho I 酶切位點，引物序列為：

上游引物：5'-GAATTCATGTCAAAGAGAAAGACTAAAGAGC-3'；下游引物：5'-CTCGAGTCAGAGCCTTCTTCCTCTTCTAC-3'。

以制備好的擬南芥cDNA為模板，擴增體系為20 μL反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。反應結(jié)束后，取出5 μL進行電泳，檢測是否擴增出目的片段，檢測到目的片段后用膠回收試劑盒進行回收。

1.2.3 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將純化后的PCR產(chǎn)物和pEASY-T3連接，用限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Xho I進行雙酶切，膠純化以后將PCR產(chǎn)物與pGEX-6P-1線性片段連接，16℃連接過夜，連接體系如表1所示。

表1 PCR產(chǎn)物與pGEX-6P-1線性片段連接體系

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37℃活化1.5 h后涂LB Amp抗性平板，置37℃倒置培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后，用抗生素篩選后的單克隆進行如下程序檢測：菌落PCR篩選—測序，最終找出正確的重組克隆。

1.2.4 重組蛋白在大腸桿菌中的表達和純化 將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞表達菌株，用0.5 mmol/L的IPTG誘導，16℃ 23 h。5 000 r/min，30 min離心，棄上清。用5 mL PBS懸浮沉淀。然后超聲破碎，4℃ 12 000 r/min 離心30 min，收集上清，上清和沉淀分別留少許進行SDS-PAGE檢測。在上清中加入適量GST beads，4℃旋轉(zhuǎn)令其吸附蛋白2.5 h；2 000 r/min，3 min離心棄上清；加入至少50 mL PBS，輕搖至beads懸浮于溶液中，2 000 r/min，3 min離心，棄上清；重復用PBS洗beads兩次； 加入1 mL GST Elution Buffer，輕搖10 min；2 000 r/min，3 min離心，收集上清；重復用GST Elution Buffer洗兩次，收集上清進行SDSPAGE檢測。通過SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 過表達的擬南芥AK6蛋白的獲得 AK6引物：上游引物：5'-GGAATTCCATATGGCGAGACGTAACCGTGGG-3'（Nde I）；下游引物：5'-CGGGATCCTCAGGGTTGCCATGCATTA-3'（BamH I）。其 他 方 法 同RRS14蛋白的制備。

1.2.6 體外pull-down尋找與RPS14相互作用的蛋白及免疫檢測 用50 μL GST beads和1 mL GST-RPS14蛋白在4℃孵育，將過表達的HIS-AK6蛋白混合液加入經(jīng)處理的GST beads中，在4℃旋轉(zhuǎn)混合孵育2 h，用冰冷的細胞裂解液洗滌重復洗3次，SDS-PAGE檢測。取膠，在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，用去離子水與PBST稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1 h。加含HIS-Tag標簽的一抗，4℃搖動孵育2 h。用PBST洗膜3次，每次5-10 min。加入相應的二抗后，用PBST再洗膜3次，每次5-10 min。最后進行自顯影。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

用Trizol從擬南芥的葉片中提取RNA，根據(jù)檢測的濃度利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20℃?zhèn)溆?，結(jié)果如圖1所示。

利用特異的上下游引物通過PCR程序從擬南芥cDNA中擴增目的條帶，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出的PCR產(chǎn)物，結(jié)果（圖2）表明獲得了與預期片段大小相符的清晰的目的條帶。

2.2 原核重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將切膠回收的目的基因PCR產(chǎn)物與pEASYT3載體連接，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I 37℃雙酶切pEASY-T3-RPS14和pGEX-6P-1，結(jié)果（圖3）顯示連接成功。把切下的目的基因和雙酶切后的pGEX-6P-1載體16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化，挑取健壯的單克隆搖菌，用菌液PCR檢測出單一條帶，結(jié)果（圖4）顯示為陽性菌株。將陽性菌株菌液送去測序。測序結(jié)果與NCBI的相關(guān)序列比對完全正確。

2.3 原核重組表達載體的表達、可溶性分析及蛋白純化

將測序正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，分別挑取健壯的單克隆培養(yǎng)至OD600=0.6，加入誘導劑IPTG在16℃誘導23 h；5 000 r/min，30 min離心，棄上清。用5 mL PBS懸浮沉淀。然后超聲破碎，上清和沉淀用SDS-PAGE檢測，如圖5-A所示。蛋白純化后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測得到比較單一的條帶，結(jié)果如圖5-B所示。

2.4 過表達擬南芥AK6蛋白

獲得AK6蛋白需構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-28a-AK6，其中pET-28a中帶有HIS標簽，便于后續(xù)試驗中進行Western blot以鑒定AK6蛋白的存在，從而證明擬南芥中RPS14蛋白與AK6蛋白發(fā)生相互作用。

2.5 核糖體組成蛋白RPS14可能與AK6相互作用

將純化后的HIS-AK6和GST-RPS14融合蛋白與GST beads共同孵育，經(jīng)離心收集洗脫復合物和洗滌后，再加入過量GSH獲得相互作用蛋白的復合物，去上清用SDS-PAGE檢測（圖6）。取膠，在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，最后進行自顯影。

Western blot檢測結(jié)果（圖7）顯示，凝膠泳道1轉(zhuǎn)移膜上出現(xiàn)明顯目的條帶，且條帶位于約26 kD處；而對照組凝膠泳道2轉(zhuǎn)移膜上無目的條帶出現(xiàn)。由于試驗組pull-down收集的上清液蛋白中，只有AK6融合蛋白帶有HIS標簽，免疫檢測加入識別HIS標簽的抗體，使HIS-AK6融合蛋白與之結(jié)合，最后顯色位置進一步證明上清液蛋白中確實存在AK6蛋白，并確定SDS-PAGE結(jié)果中出現(xiàn)的26 kD處條帶是AK6蛋白，從而也進一步證明擬南芥中RPS14蛋白與AK6蛋白確實存在相互作用，共同調(diào)控細胞能量代謝平衡，這在AK6缺失導致擬南芥生長矮化的機制中可能發(fā)揮了重要作用。

3 討論

擬南芥腺苷酸激酶6（AA6）是P-loop激酶家族成員，該激酶家族具有典型、保守的Walk A和Walk B結(jié)構(gòu)域，其中Walk A結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合NTP分子，Walk B結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合重要的輔因子Mg2+，能使NTP+NMP=2NDP。核苷酸的平衡對多種細胞內(nèi)的功能非常重要，如細胞內(nèi)能量的代謝及DNA和RNA的合成等。

由于AK6是腺苷酸激酶，在體外試驗中，除酵母外，人類、線蟲、果蠅AK6的同源蛋白都具有激酶活性［8，9］，能使所有類型的NTPs和dNTPs充當磷酸供體，最適磷酸供體是ATP和dATP。同時，與擬南芥野生型植株相比，aak6-/aak6-純合突變體植株表現(xiàn)出明顯的矮化［10］，暗示AK6基因的缺失影響了細胞的形態(tài)和生長。

研究發(fā)現(xiàn)，酵母RPS14蛋白C端精氨酸突變成丙氨酸時，與Fap7（AK6的同源蛋白）缺失的表型相似，證實YAK6（Fap7）能與核糖體蛋白質(zhì)RPS14互作，共同促進20S rRNA前體中D位點的剪接過程，使20S rRNA前體剪接為成熟的18S rRNA，再進一步組裝為40S核糖體小亞基。如果把Fap7上Walk A和Walk B 結(jié)構(gòu)域中幾個保守的氨基酸突變以后，能明顯抑制20S rRNA前體的剪接和細胞的生長［11］，說明RPS14基因?qū)NA的編輯起重要作用。

推測在擬南芥中，RPS14和AK6也可能存在相互作用。將GST空載，GST-RPS14融合蛋白和HISAK6融合蛋白在細菌中過表達，并親和層析純化。將純化后的GST空載，GST-RPS14蛋白分別與HISAK6蛋白在冰上同GST beads孵育，純化的GST空載作為負對照。用SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示GSTRPS14和HIS-AK6特異性的結(jié)合，而負對照組不發(fā)生結(jié)合。Western blot進一步證實GST-RPS14和HISAK6在體外有相互作用。

4 結(jié)論

本研究選用模式植物擬南芥作為試驗材料克隆了RPS14基因和AK6基因，并獲得其可溶性蛋白GST-RPS14和HIS-AK6。運用體外GST pull-down技術(shù)得出，擬南芥 RPS14蛋白與AK6蛋白存在相互作用。

［1］ Granneman S, Nandineni MR, Baserga SJ. The Putative NTPase Fap7 mediates cytoplasmic 20S pre-rRNA processing through a direct interaction with RpS14［J］. Mol Cell Biol, 2005, 25（23）：10352-10364.

［2］ Whitford PC, Miyashita O, Levy Y, Onuchic JN. Conformational transitions of adenylate kinase：Switching by cracking［J］. J Mol Biol, 2007, 366（5）：1661-1671.

［3］ Van Rompay AR, Johansson M, Karlsson A. Identifucation of a novel human adenylate kinase. cDNA cloning, expression analysis, chromosome localization and characterization of the recombinant protein［J］. Eur J Biochem, 1999, 261：509-517.

［4］ Zancani M, CasoloV, VianelloA, Macri F. Involvement of apyrase in the regulation of the adenylate pool by adenylate kinase in plant mitochondria［J］. Plant Sci, 2001, 161（5）：927-933.

［5］ Zhai R, Meng G, Zhao Y, et al. A novel nuclear-localized protein with special adenylate kinase properties from Caenorhabditis elegans［J］. FEBS Lett, 2006, 580（16）：3811-3817.

［6］ Ren H, Wang L, Bennett M, et al. The crystal structure of human adenylate kinase 6：An adenylate kinase localized to the cell nucleus［J］. Proc Natl Acad Sci, 2005, 102（2）：303-308.

［7］ Lange PR, Geserick C, Tischendorf G, Zrenner R. Functions of chloroplastic adenylate kinases in Arabidopsis［J］. Plant Physiology, 2007, 146（2）：492-504.

［8］ Juhnke H, Charizanis C, Latifi F, et al. The essential protein fap7 is involved in the oxidative stress response of Saccharomyces cerevisiae［J］. Mol Microbiol, 2000, 35（4）：936-948.

［9］ Carrari F, Coll-Garcia D, Schauer N, et al. Deficiency of a plastidial adenylate kinase in Arabidopsis results in elevated photosynthetic amino acid biosynthesis and enhanced growth［J］. Plant Physiologl, 2005, 137（1）：70-82.

［10］ Zhang J, Zhang F, Zheng X. Depletion of hCINAP by RNA interference causes defects in Cajal body formation, histone transcription, and cell viability［J］. Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67（11）：1907-1918.

［11］ Meng G, Zhai R, Chen B, et al. Identification and characterization of human adenylate kinase 6 homologues from Drosophila melanogaster［J］. Biochemistry（Moscow）, 2008, 73（1）：38-43.