轉(zhuǎn)ZjAPX基因擬南芥對NaCl、干旱脅迫的耐性研究

郭慧娜 孟玉平 郝子琪 李倩 曹秋芬，3

（1.山西大學生物工程學院，太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，太原 030031）

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物體內(nèi)酶促抗氧化系統(tǒng)中ASA-GSH氧化還原途徑的重要組分，是清除H2O2的關(guān)鍵酶，對H2O2有較高的親和力，在還原底物抗壞血酸的存在下將H2O2還原為H2O。大量的研究表明，APX 的表達受各種環(huán)境脅迫因子，如干旱、高鹽、除草劑、低溫、病原菌侵染的誘導。馬長樂等［1］研究表明，當堿蓬受到NaCl脅迫時，其SsAPX的表達量增高。在煙草葉綠體中，過量表達擬南芥APX基因能夠清除活性氧，提高轉(zhuǎn)基因株系耐鹽能力［2］。木本植物中白樺抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因已經(jīng)被克隆，研究表明NaCl脅迫誘導了白樺葉片中APX的表達［3］；木本果樹中葡萄的APX［4］和蘋果的APX基因也已被克?。?］，李穎等［6］利用農(nóng)桿菌介導已經(jīng)將蘋果的APX基因轉(zhuǎn)入“嘎啦”組培苗。

棗樹抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄，這些特性與其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)有密切關(guān)系，我們從棗樹結(jié)果枝cDNA文庫中篩選出一個抗壞血酸過氧化物酶基因，命名為ZjAPX，在DDBJ/EMBL/GenBank的注冊號為AB608053，并對ZjAPX進行了原核表達蛋白的研究［7］和cDNA序列生物信息學分析及完整開放閱讀框植物表達載體PEZR（K）-LNY-ZjAPX的構(gòu)建［8］。本研究通過凍融法將已構(gòu)建的植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，并借助農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)ZjAPX擬南芥，通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行NaCl、干旱脅迫，觀察植株的表型變化、檢測其體內(nèi)ZjAPX的表達，探討ZjAPX在改善植物抗旱耐鹽性方面的生物學作用，旨在為利用生物工程手段提高植物抗旱、耐鹽性提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用重組植物表達載體PEZR（K）-LNY由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心植物細胞及胚胎學研究室保存，前期研究中已經(jīng)將ZjAPX成功連接到PEZR（K）-LNY載體上，構(gòu)建了PEZR（K）-LNY-ZjAPX［8］，該載體攜帶篩選標記基因NPT-Ⅱ和黃色熒光蛋白報告基因YFP。野生型擬南芥株系（Arabidopsis thaliana Columbia）和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株由該研究室保存。

卡那霉素（Kanamycin，Kan）購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；NaCl、YEB、1/2MS培養(yǎng)基中所用試劑均購自天津天大化工；擬南芥的培養(yǎng)基質(zhì)購自山西省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所；飽和酚、DEPC、RNA和DNA提取過程中所用到的試劑均購自上海生工生物工程有限公司。DL2000 Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT Master Mix），熒光定量PCR試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit），DNaseⅠ，熒光定量過程中所用的PCR管均購自大連TaKaRa（寶生物）工程有限公司。用于PCR鑒定和熒光定量的引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成；熒光定量PCR儀為Applied Biosystems 的7300 Real Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng) 將擬南芥種子消毒后，播于1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口。春化2 d后，將其置于21℃，16 h/8 h光周期條件下進行培養(yǎng)。當擬南芥長出兩片真葉時，移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 農(nóng)桿菌工程菌PEZR（K）-LNY-ZjAPX-L的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥 通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PEZR（K）-LNY-ZjAPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，挑取陽性菌落進行PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，將陽性菌株送華大基因公司測序。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的篩選 將T0代種子消毒后，播于含有卡那霉素的1/2MS抗性平板上篩選，篩選出的抗性植株分株系收獲種子，記為T1代。同樣，將T1代種子抗性篩選，收獲T2種子。將T2代種子消毒后播于含有卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在平板上生長全為綠苗的為純合的轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 采用CTAB法提取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA，通過蛋白核酸檢測儀檢測其濃度和純度；以提取的基因組DNA為模板進行PCR檢測，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其 中：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq聚合酶0.1 μL，上下游引物各1 μL（20 pmol/μL），用滅菌無離子水補足20 μL。

APX1正向引物：5'-TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3'；APX2反向引物：5'-ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株T2代種子的NaCl脅迫處理 種子脅迫培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基中分別加不同濃度的NaCl，即100、200、300和500 mmol/L，以不加NaCl的1/2MS培養(yǎng)基為對照。

將PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥T2代的種子消毒后，每一個株系在每一個濃度的培養(yǎng)基上均播種約20顆種子，同時每個培養(yǎng)皿中播野生型擬南芥種子作對照，觀察種子萌發(fā)及植株生長狀況。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因T2代植株的NaCl和干旱處理 將正常生長3周左右的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株分別進行干旱（不澆水）和澆400 mmol/L NaCl處理，以正常澆水為對照，10 d后調(diào)查植株生長情況，并分別取樣冷凍于液氮后保存在-80℃超低溫冰箱中，備用。

1.2.7 NaCl和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥中ZjAPX基因的表達 用CTAB法［9］提取上述處理樣品的RNA，用DNaseⅠ除去DNA。用蛋白核酸分光光度計檢測其A260/280在1.8-2.0之間，凝膠電泳發(fā)現(xiàn)28S和18S的rRNA條帶完整，28S條帶的亮度為18S亮度的2倍，表明總RNA有較好的完整性和純度，能滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：5×Prime Script Buffer 4 μL、Total RNA 1 μg、總體積15 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。用Realtime PCR的方法分析基因的轉(zhuǎn)錄表達情況。本研究采用Real-time PCR相對定量法，分析轉(zhuǎn)基因植株不同脅迫條件下ZjAPX mRNA的相對表達量。ZjAPX的上游引物為：5'-TCGATATCGCTGTCAGACTAC-3'；下游引物：5'-TTGTCCTCTCTTCCTGGATG-3'；可擴增出145 bp的片段。以擬南芥Actin（At3g18780）基因作內(nèi)參，其上游引物：5'-ACCTCATGAAGATCCTTACAG-3'；下游引物：5'-GATGGAAGAGCTGGTCTTTG-3'；可擴增出146 bp的片段定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含上、下游引物各0.4 μL（20 pmol/μL），cDNA 1 μL（100 ng），SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸31 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Χ勘磉_分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt = 轉(zhuǎn)基因［Ct（ZjAPX）-Ct（Actin）］-野 生 型［Ct（ZjAPX）-Ct（Actin）］，每個樣品重復3次。

對于天文攝影師來說，自然少不了大大小小的器材，這些都能整齊地收納到一個體積小巧的背包中。Alyn目前使用的是索尼A7 III微單相機，作為靜態(tài)照片拍攝的主力，但鏡頭的選擇更為重要。他需要廣角鏡頭，也需要光圈盡可能大，這樣就可以在不使用過高ISO的前提下，讓更多的光線進入相機。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的植物表達載體PEZR（K）-LNY-ZjAPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，涂布于含有卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃過夜培養(yǎng)，挑選生長良好的單菌落，進行PCR檢測，產(chǎn)生一條大小約為750 bp的特異條帶（圖1），兩個菌株測序表明，重組載體上的序列與原克隆序列完全相同，證明含PEZR（K）-LNY-ZjAPX的農(nóng)桿菌工程菌構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的篩選

將T0代種子播在含有卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上篩選，未轉(zhuǎn)化的擬南芥種子長出兩片子葉后黃化死亡，只有轉(zhuǎn)基因擬南芥種子能夠繼續(xù)正常生長，如圖2所示。經(jīng)過抗性篩選共獲得24個轉(zhuǎn)基因株系，24個株系整體生長狀況良好，沒有發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)及性狀。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

將篩選獲得的24個T0轉(zhuǎn)基因株系繼續(xù)分別用含有卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選至獲得T2代種子，播種其中的5個株系3、8、9、11、20進行PCR鑒定證明，5個株系均擴增出了750 bp的條帶（圖3），表明5個株系均為轉(zhuǎn)ZjAPX基因植株。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系種子對NaCl的耐性

播種后第7天，300 mmol/L和500 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上種子沒有發(fā)芽長出子葉，而0 mmol/L NaCl和100 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上子葉展開，10 d長出兩片真葉，但含100 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上的幼苗葉子卷曲；15 d轉(zhuǎn)基因擬南芥的幼苗的長勢明顯好于野生擬南芥；30 d野生型植株幼苗根系短小、葉片發(fā)黃接近死亡，而轉(zhuǎn)基因株系幼苗的根系和葉片明顯優(yōu)于野生型植株，如圖4所示。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系的耐NaCl、耐旱性

對轉(zhuǎn)基因植株進行NaCl和干旱脅迫處理15 d后觀察，與正常澆水的對照相比NaCl處理的植株均表現(xiàn)葉片變黃，但轉(zhuǎn)基因株系比野生型植株更健壯、葉片大、葉色稍綠。干旱處理的轉(zhuǎn)基因株系均正常生長，株系3和株系11葉片表現(xiàn)為深綠色，株系8葉色正常并已經(jīng)抽苔，株系9長勢稍差，而此時野生型植株已干枯死亡。

2.6 NaCl和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中ZjAPX基因的表達

熒光定量PCR分析結(jié)果表明，NaCl和干旱脅迫10 d的轉(zhuǎn)基因株系的ZjAPX表達量均顯著高于野生型株系，如圖5所示。其中以株系3表達量最高，相對表達量分別為114%和146%，其次株系8分別為73%和76%，株系11分別為17%和20%，株系9均為11%；NaCl脅迫條件下野生型植株ZjAPX表達量很低為0.1%幾乎為0，而干旱脅迫10 d采樣時野生型植株已經(jīng)死亡。這一結(jié)果與上述2.5中的外部形態(tài)觀察結(jié)果基本一致，株系3在脅迫條件下生長最好，ZjAPX的相對表達量也最高；株系9在脅迫條件下生長最弱，ZjAPX的相對表達量也最低；證明轉(zhuǎn)ZjAPX植株的耐NaCl和耐干旱性與ZjAPX的高表達呈正相關(guān)，ZjAPX的高表達提高了植株耐NaCl和耐干旱的能力。

3 討論

植物在受到鹽、干旱等逆境脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS的種類包括過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、超氧陰離子（O2-）。當ROS代謝平衡遭到破壞、產(chǎn)生的量超出植物體本身的清除能力時，過剩的H2O2會生成破壞力更強的HO-，從而導致膜脂的過氧化，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能，蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子受到傷害，細胞物質(zhì)交換平衡遭到破壞，生理生化代謝出現(xiàn)紊亂，使植物生長受到抑制［10］。因此，能否及時清除過量積累的活性氧，緩解脅迫對植物細胞造成的傷害，在一定程度上反映了植物耐鹽、耐旱等抗逆性的強弱。研究表明，在高等植物中，抗壞血酸（Ascorbic acid，ASA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環(huán)是植物葉綠體和胞質(zhì)中清除H2O2的主要系統(tǒng)，而APX是這個系統(tǒng)的關(guān)鍵酶［11］，因此APX的表達量高低直接影響植物在逆境中的生存能力。

對APX的研究發(fā)現(xiàn)，在干旱、臭氧、乙烯、除草劑、冷熱等逆境條件，以及病原體侵染以及果實成熟過程中，均能引起APX的mRNA 水平及其活性的增加［12］。本研究證明在NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)ZjAPX擬南芥的種子萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗的生長、根系明顯優(yōu)于野生型植株，說明轉(zhuǎn)ZjAPX改善了擬南芥種子及幼苗對NaCl的耐性。在NaCl和干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)ZjAPX擬南芥植株的生長勢均明顯優(yōu)于野生型植株，熒光定量PCR分析也證明ZjAPX基因在mRNA水平的表達量明顯高于野生型植株；同時研究還表明轉(zhuǎn)基因株系之間抗脅迫能力存在差異，株系3、8、11生長勢優(yōu)于株系9，ZjAPX基因表達量也表現(xiàn)出明顯的不同，依次為株系3、8、11、9。這一結(jié)果說明ZjAPX基因在植物體內(nèi)高表達量清除了活性氧，提高了植株對NaCl和干旱脅迫的抗性；由于不同株系中導入的基因拷貝數(shù)、基因整合的位置存在差異，因而株系之間對NaCl和干旱的耐性也表現(xiàn)不同。

Gueta-Dahan等［13］對耐鹽和鹽敏感的柑橘中抗氧化酶的活性發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的活性在兩者之間差別不大，而耐鹽柑橘中的APX活性大大高于鹽敏感柑橘；Tsugane等［14］也發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比，在鹽脅迫條件下能進行光合自養(yǎng)的擬南芥隱性突變體中APX的活性顯著增強，而其他幾種抗氧化物酶的活性差別不大，因此認為APX是決定耐鹽與否的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果也證明了這一點。

增強植物抗逆性的重要途徑之一是提高植物體內(nèi)活性氧清除酶類的活性及抗氧化代謝水平。利用基因工程手段將一些具有抗逆功能的轉(zhuǎn)錄因子導入植株中，是目前普遍使用的提高植物抗逆性的策略。

4 結(jié)論

本研究利用農(nóng)桿菌介導法將ZjAPX基因轉(zhuǎn)入到模式植物擬南芥，轉(zhuǎn)ZjAPX擬南芥T2株系的種子萌發(fā)和植株生長均較野生型株系耐鹽、耐旱，熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽脅迫處理10 d后目的基因ZjAPX的表達量顯著高于野生擬南芥，證明轉(zhuǎn)ZjAPX能夠提高植物的耐鹽和耐旱性。

［1］ 馬長樂, 王萍萍, 曹子誼, 等.鹽地堿蓬（Suaede sdlsa）APX基因的克隆及鹽脅迫下的表達［J］.植物生理與分子生物學學報, 2002, 28（4）：261-266.

［2］ Badawi GH, Kawano N, Yamauchi Y, et al. Overexpression of arscorbate peroxidase in tobacco chloroplasts enhances the tolerance to salt stress and water deficit［J］. Physiol Plant, 2004, 121（2）：231-238.

［3］ 王超, 楊傳平, 王玉成.白樺抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因克隆及表達分析［J］.東北林業(yè)大學學報, 2009, 37（3）：70-81.

［4］ 林玲.中國華東葡萄抗壞血酸過氧化物酶基因的原核表達抗體制備［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學, 2006.

［5］ 栗霞.蘋果抗壞血酸過氧化物酶基因的克隆及其植物表達載體的構(gòu)建［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學, 2007.

［6］ 李穎, 馬鋒旺.抗壞血酸過氧化物酶基因轉(zhuǎn)化蘋果的研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學報, 2010, 19（1）：140-163.

［7］ 張曉娟, 郝子琪, 楊大威, 等.棗樹ZjAPX基因的原核表達［J］.山西農(nóng)業(yè)科學, 2012, 40（3）：189-192.

［8］ 郝子琪, 許洪仙, 孟玉平, 等.棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因ZjAPX生物信息學分析及植物表達載體的構(gòu)建［J］.山西農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39（5）：400-403.

［9］ 曹秋芬, 孟玉平, 孫毅.蘋果屬植物總RNA有效、快速提取方法簡介［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2003, 11（4）：428-429.

［10］ 王聰, 朱月林, 楊立飛, 陳磊. NaCl脅迫對菜用大豆抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學報, 2010, 16（5）：1209-1216.

［11］ 李惠華, 賴鐘雄. 植物抗壞血酸過氧化物酶研究進展［J］.亞熱帶植物科學, 2006, 35（2）：66-69.

［12］ Sch?ner S, Krause GH. Protective systems against active oxygen species in spinach：response to cold acclimation in excess light［J］. Planta, 1990, 180：383-389.

［13］ Gueta-Dahan Y, Yaniv Z, Zilinskas BA, Ben-Hayyim G. Salt and oxidative stress：similar and specific responses and t heir relation to salt tolerance in citrus［J］. Planta, 1997, 203：460-469.

［14］ Tsugane K, Kobayashi K, Niwam Y, et al. A recessive Arabidopsis mutant that grows photoautotrophically under salt stress shows enhanced active oxygen detoxification［J］. Plant Cell, 1999, 11（7）：1195-1206.