• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    南方紅豆杉內生真菌的分離鑒定及其細胞毒活性研究

    2013-12-23 05:45:38張慶波陳玉嬋李浩華潘清靈王磊李冬利陶美華章衛(wèi)民
    生物技術通報 2013年1期
    關鍵詞:細胞毒粗提物紅豆杉

    張慶波 陳玉嬋 李浩華 潘清靈 王磊 李冬利 陶美華 章衛(wèi)民

    (1. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室 廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,廣州 510070;2. 中國科學院南海海洋研究所,廣州 510301)

    南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K)為紅豆杉屬(Taxus Linn)植物,主要分布于長江流域、南嶺山脈山區(qū)及河南、陜西(秦嶺)、甘肅等省。自紅豆杉中發(fā)現(xiàn)具有獨特抗癌機制的紫杉醇后,人們開始大量從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇,致使紅豆杉資源遭到嚴重破壞。為解決紫杉醇的新來源,人們采用了各種不同的方法,并取得了一定的成果。1991年,Christen等通過太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)的組織培養(yǎng)獲得了紫杉醇[1];1994年,Nicolaou等[2]完成了紫杉醇的全合成。1993年,Stierle等[3]從太平洋紅豆杉樹皮內生真菌Taxomyces andreanae的發(fā)酵液中分離得到了紫杉醇,這一發(fā)現(xiàn)使紅豆杉屬植物中內生真菌及其次生代謝產物的研究成為熱點,并發(fā)現(xiàn)許多內生真菌都能夠產生紫杉醇或具有紫杉醇類似結構的代謝產物[47]。本研究對產自廣東的南方紅豆杉進行內生真菌的分離和鑒定,探討南方紅豆杉內生真菌的多樣性,并對分離到的內生真菌的發(fā)酵粗提物進行體外細胞毒活性研究,旨在篩選出具有良好抗腫瘤活性的菌株,為進一步研究其活性次生代謝產物奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    南方紅豆杉樣品,包括葉、枝條、果實及樹皮,2008年10月采自廣東省大東山自然保護區(qū)。

    Taq酶及其他PCR相關試劑購于大連寶生物工程有限公司,其他分析純化學試劑均為市售。

    人神經膠質瘤細胞SF-268、人肺癌細胞NCIH460、人乳腺癌細胞MCF-7,均保存于廣東省微生物研究所。

    DMI 3000 B倒置顯微鏡(Leica);S-3000 N掃描電鏡(日立);EPS 3501電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech); ImageQuant 350 凝膠成像儀;LAMBDA-E酶標儀(Biotech);2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱(Shellab);Mastercycler gradient 5331 PCR儀(Eppendof);RE-2000旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);THZ-C-1搖床(廣州市正一科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 內生真菌的分離 將采集的新鮮樣品用流水沖洗,然后用無菌水漂洗2次,放入75%的乙醇中浸泡7 min,取出后用無菌水漂洗3次,再放入0.1%的升汞溶液中浸泡5-7 min,取出后用無菌水漂洗4次。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5 cm×0.5 cm 的方塊;枝條用無菌手術刀削去四周,取中間部位剪成1 cm長的小段;樹皮用手術刀去掉外皮層后,剪成0.5 cm×0.5 cm小塊;果實剝去外皮,取中間部位,剪成小塊。用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對照。處理好的樣品放入事先準備好的PDA平板(含20 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中,26℃恒溫培養(yǎng),待長出菌絲后,挑取平板中單一菌落進一步純化,純化后的菌株轉接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上,4℃冰箱保存。

    1.2.2 內生真菌的鑒定

    1.2.2.1 形態(tài)學鑒定 肉眼觀察分離菌株在PDA平板上的培養(yǎng)特征;用光學顯微鏡觀察菌絲、孢子、產孢結構等形態(tài)特征;用掃描電鏡觀察部分菌株的孢子、產孢結構等特征;參考《真菌鑒定手冊》[8],對分離菌株進行初步鑒定。

    掃描電鏡樣品制備和觀察:將PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10 d的培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊,經3%戊二醛固定5 h,PBS緩沖鹽洗滌;1%鋨酸固定2 h,PBS緩沖鹽洗滌;乙醇、丙酮脫水后,用乙酸異戊酯置換其中的溶劑(2次)。完全脫水后的樣品臨界點干燥3 h,噴金,掃描電鏡觀察。

    1.2.2.2 分子鑒定 總DNA的制備參考王磊等[9]的方法。PCR擴增采用真菌rDNA內轉錄間隔區(qū)(rDNA ITS)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3',正向)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',反向)[10]擴增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20 μL反應體系,通過Ex Taq(TaKa-Ra)進行,反應條件為93℃預變性3 min;93℃變性45 s,55℃復性45 s,72℃延伸1.5 min,共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應產物利用PCR產物純化試劑盒(QIAGEN)純化,純化后的樣品由廣州景瑞生物科技有限公司進行測序。測序獲得的序列通過BLAST 程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析。

    1.2.3 細胞毒活性研究

    1.2.3.1 發(fā)酵液提取物的制備 從斜面挑取少許菌絲接種到PDA平板上活化3 d,挑取活化后的菌絲(連同培養(yǎng)基)轉接到裝有500 mL PD培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中,26℃,120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)物抽濾后,收集濾液,濾液用乙酸乙酯萃取3次,萃取液于40℃下減壓濃縮至干,得到發(fā)酵液粗提物備用。

    1.2.3.2 發(fā)酵粗提物的細胞毒活性測定 采用MTT法[11]測定發(fā)酵粗提物對腫瘤細胞SF-268、NCIH460和MCF-7的生長抑制率,各粗提物的作用濃度為100 μg/mL,以順鉑作為陽性對照,作用濃度為20 μg/mL,每處理重復3次。

    2 結果

    2.1 內生真菌的分離及鑒定

    從南方紅豆杉的葉、枝條、樹皮及果實中共分離到內生真菌55株,根據(jù)培養(yǎng)特征將這些菌株分成32類,測序后獲得22條不同的序列,將這些序列通過BLAST 程序在GenBank上進行序列相似性檢索分析,結果見表1。

    從表1可以看出,分離菌株中能確定種的有膠孢刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果球座菌(Guignardia mangiferae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、暗色節(jié)菱孢(Arthrinium phaeospermum)和細交鏈孢菌(Alternaria alternata);確定到屬的有炭角菌屬(Xylaria)、毛殼菌屬(Chaetomium)、擬莖點霉屬(Phomopsis)和長蠕孢屬(Helminthosporium);只能確定為植物內生真菌而未能確定其種屬的有4株;而菌株A213、A220、A239和A241與最相似物種的相似率低,分別為92.1%、94.9%、93.1%和92.3%,有待作進一步鑒定。A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征見圖1及表2。

    表 1 分離及測序結果

    2.2 內生真菌的抗腫瘤活性

    除了菌株A229和A232外,對其余20個菌株的發(fā)酵粗提物進行了體外細胞毒活性測試,結果見表3。從表3中可以看出,有4株內生真菌對神經膠質瘤細胞SF-268的抑制率在50%以上,有2株對肺癌細胞NCI-H460的抑制率在50%以上,有6株對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在50%以上,其中菌株A223和A240對MCF-7的抑制率均在90%以上。

    圖1 菌株形態(tài)特征

    表 2 菌株A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征

    表3 發(fā)酵粗提物細胞毒活性(作用濃度為100 μg/mL)

    3 討論

    內生真菌在植物體內廣泛分布,這種分布既有一定的宿主或組織專一性,又受宿主生長環(huán)境的影響,具有豐富的多樣性。同一植物在不同的地理區(qū)域具有不同的內生真菌類群分布[12]。紅豆杉的內生真菌多樣性豐富,到目前為止已從紅豆杉屬植物中分離到不少不同種屬的內生真菌(表4)。與已報道的南方紅豆杉內生真菌比較,本研究首次從生長于廣東地區(qū)的南方紅豆杉中分離獲得了以往未見報道的內生真菌,且菌株A213、A220、A239、A241與GenBank中最相似物種的相似率低,是否為新的種屬有待進一步研究。可見,從不同地理區(qū)域的南方紅豆杉中可以獲得不同類群的內生真菌資源。

    紅豆杉內生真菌活性次級代謝產物的研究逐漸被人們所重視,已成為研究抗腫瘤藥物和其他藥物的重要資源。如從太平洋紅豆杉植物內生真菌Taxomyces andreanae中分離得到的紫杉醇是一種活性很好的抗微管蛋白聚合的藥物,已經被開發(fā)成為抗腫瘤藥物應用于臨床。此外,人們還從紅豆杉屬植物中分離到能夠產生抗腫瘤活性物質的其他真菌。如王建鋒[27]等從紅豆杉皮層中分離到一株瘤座孢(Tubercularia sp.),發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物在體外有較強的抗腫瘤活性;李桂玲[16]等從三尖杉、南方紅豆杉及香榧中分離到172株植物內生真菌,利用MTT法對其進行活性檢測表明,25株內生真菌對KB人口腔上皮癌或HL-60人白血病細胞具有顯著的抑制作用。本研究對20株內生真菌發(fā)酵粗提物進行細胞毒活性研究,結果有6株對至少1種受試腫瘤細胞株的抑制率在50%以上,占受試菌株總數(shù)的30%,其中菌株A223和A240對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在90%以上,值得對其活性次生代謝產物進行深入研究。

    表4 部分南方紅豆杉及其同屬植物中的內生真菌

    4 結論

    本研究首次從南方紅豆杉中分離獲得了球座菌屬、座腔菌屬、炭角菌屬、節(jié)菱孢屬及長蠕孢屬的內生真菌,豐富了南方紅豆杉內生真菌的種類和數(shù)量;活性研究發(fā)現(xiàn)部分內生真菌的發(fā)酵粗提物具有良好的細胞毒活性。

    [1] Christen AA, Gibson DM, Bland J, et al. Production of taxol or taxollike compounds in cell culture:USA, 5019504[P].1991-5-28.

    [2] Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, et al. Total synthesis of taxol[J]. Nature, 1994, 367:630-634.

    [3] Stierle A, Strobel G, Stierle D, et al. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science, 1993, 260:214-214.

    [4] 金濤, 王偉, 劉軍, 等. 東北紅豆杉內生真菌的分離及產紫杉醇菌的鑒定[J].中草藥, 2007, 38(5):770-772.

    [5] 段麗麗, 陳鴻銳, 陳杰鵬, 等. 選育紫杉醇高產菌種鏈格孢單孢變種[J].中國抗生素雜志, 2008, 33(11):650-652.

    [6] Xiang Y, Lu AG, Wu WF, et al. Identification of Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. endophytic fungi-new species, species known and their metabolite[J]. J Forest Res, 2003, 14(4):290-294.

    [7] 葛菁萍, 平文祥, 馬璽, 等. 紫杉醇產生菌 HU1353 的鑒定[J].微生物學雜志, 2004, 24(3):19-21.

    [8] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海:上??萍汲霭嫔? 1979.

    [9] 王磊, 章衛(wèi)民, 李浩華, 等. 白木香內生真菌的分離及分子鑒定[J]. 菌物研究, 2009, 7(1):37-42.

    [10] White TJ, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols:a guide to methods and applications[M]. San Diego:Academic Press, 1990:315-322.

    [11] 李冬利, 張慶波, 陳玉嬋, 等. 白木香內生真菌抗腫瘤抗菌活性的篩選研究[J]. 微生物學雜志, 2009, 29(5):26-29.

    [12] 郭良棟. 內生真菌研究進展[J]. 菌物系統(tǒng), 2001, 20(1):148-152.

    [13] 王偉, 賀雄雷. 南方紅豆杉內生菌及紫杉烷類產物的初步鑒定[J]. 中山大學學報:自然科學版, 1999, 8(3):116-118.

    [14] 孫端方, 冉雪琴, 王嘉福. 一株產紫杉醇羅漢松內生真菌的分離和鑒定[J]. 微生物學報, 2008, 48(5):589-595.

    [15] Wang JF, Li GL, Lu HY, et al. Taxol from Tubercularia sp. strain TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei[J]. FEMS Microbiol Lett, 2000, 193(2):249-253.

    [16] 李桂玲, 王建鋒, 黃耀堅, 等. 植物內生真菌抗腫瘤活性菌株的篩選[J]. 菌物系統(tǒng), 2001, 20(3):387-391.

    [17] 李桂玲, 王建鋒, 黃耀堅, 等. 幾種藥用植物內生真菌抗真菌活性的初步研究[J]. 微生物學通報, 2001, 28(6):64-68.

    [18] 張永杰, 王建鋒, 黃耀堅, 等. 4種裸子植物內生真菌抗腫瘤菌株的篩選[J]. 廈門大學學報:自然科學版, 2002, 41(6):804-809.

    [19] 傅科鶴, 章初龍, 劉樹蓬, 等. 南方紅豆杉內生真菌的抗菌活性[J]. 植物保護學報, 2006, 33(3):268-272.

    [20] 田仁鵬, 楊橋, 周國玲, 等. 一株產紫杉醇的南方紅豆杉內生真菌的分離及分類研究[J]. 武漢植物學研究, 2006, 4(6):541-545.

    [21] 李嘉琳, 胡鳶雷, 陳維多, 等. 紅豆杉內生真菌產紫杉醇相關基因 BAPT 的鑒定及初步研究[J]. 生物技術通報, 2006(增刊):356-361.

    [22] Guo BH, Wang YC, Zhou XW, et al. An endophytic taxol-producing fungus BT2 isolated from Taxus chinensis var. mairei[J]. Afr J Biotechnol, 2009, 5(10):875-877.

    [23] 郭曉靜, 王俊鵬, 宋曉平, 等. 南方紅豆杉產紫杉醇內生真菌的分離鑒定[J]. 西北植物學報, 2007, 27(9):1874-1878.

    [24] 余艷, 胡昌華. 南方紅豆杉內生真菌 Bionectria sp. 的分離、鑒定及代謝產物活性研究[J].西南大學學報:自然科學版, 2007, 29(6):31-135.

    [25] 程龍, 馬奇明, 陶冠軍, 等. 一株產紫杉醇的絲狀真菌的系統(tǒng)分類鑒定[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 37(4):23-30.

    [26] Wei YM, Zhou XW, Liu L, et al. An efficient transformation system of taxol-producing endophytic fungus EFY-21(Ozonium sp.)[J]. Afr J Biotechnol, 2010, 9(12):1726-1733.

    [27] 王建鋒, 呂華鷹, 黃耀堅, 等. 一株新的紫杉醇產生菌及其抗腫瘤活性[J]. 廈門大學學報:自然科學版, 1999, 38(4):485-487.

    猜你喜歡
    細胞毒粗提物紅豆杉
    為什么紅豆杉的果子不能吃?
    牛蒡根皮多酚、多糖粗提物對海蘭褐殼蛋雞產蛋性能及血液生化指標的影響
    痛風散粗提物鎮(zhèn)痛實驗研究
    云南化工(2021年5期)2021-12-21 07:41:20
    植物粗提物可作為防治獼猴桃根結線蟲的綠色藥劑
    崗松中二氫黃酮的分離、絕對構型的確定及細胞毒活性
    廣藿香內生真菌Daldinia eschscholzii A630次級代謝產物及其細胞毒活性研究
    紅豆杉
    西江月(2018年5期)2018-06-08 05:47:42
    微紫青霉菌次級代謝產物的化學成分和細胞毒活性
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:47
    南方紅豆杉瀕危原因及保育技術
    幽門螺桿菌細胞毒導致胃癌發(fā)生的作用機制
    eeuss影院久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 淫秽高清视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲熟妇熟女久久| a级毛片a级免费在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲最大成人av| 一夜夜www| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美最新免费一区二区三区 | 美女 人体艺术 gogo| 国内精品久久久久精免费| 99视频精品全部免费 在线| 久久这里只有精品中国| 亚洲av第一区精品v没综合| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99久久精品一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| 免费av毛片视频| 丝袜美腿在线中文| 久久精品国产亚洲av天美| 国产毛片a区久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人aa在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美+亚洲+日韩+国产| 有码 亚洲区| 亚洲成av人片免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 日本黄大片高清| 黄片小视频在线播放| 午夜福利在线观看吧| 免费黄网站久久成人精品 | 桃红色精品国产亚洲av| 天堂网av新在线| 午夜两性在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 男人的好看免费观看在线视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产乱人伦免费视频| 在线观看一区二区三区| 午夜免费激情av| 乱码一卡2卡4卡精品| 麻豆成人av在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99国产精品一区二区蜜桃av| 高清在线国产一区| av在线蜜桃| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 1024手机看黄色片| 怎么达到女性高潮| 此物有八面人人有两片| avwww免费| 麻豆成人av在线观看| 最新中文字幕久久久久| 性色avwww在线观看| 又爽又黄a免费视频| 99视频精品全部免费 在线| 宅男免费午夜| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精品久久久久久久久久久久久| 在线观看66精品国产| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产在视频线在精品| 日韩欧美在线乱码| 一本综合久久免费| 婷婷亚洲欧美| 日本黄大片高清| 此物有八面人人有两片| 久久国产精品影院| 在线观看av片永久免费下载| 91av网一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18禁在线播放成人免费| 男插女下体视频免费在线播放| 日本黄色片子视频| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久久久久中文| 小说图片视频综合网站| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 一级黄色大片毛片| 国产成人福利小说| 99久国产av精品| 国内精品一区二区在线观看| 美女黄网站色视频| 亚洲人成电影免费在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久成人免费电影| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲成av人片免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产高清视频在线播放一区| 欧美日韩乱码在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女高潮的动态| 久久久久免费精品人妻一区二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 麻豆国产av国片精品| a级一级毛片免费在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久精品人妻少妇| а√天堂www在线а√下载| 日本三级黄在线观看| 欧美三级亚洲精品| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲人成网站在线播| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品色激情综合| 可以在线观看的亚洲视频| 中文资源天堂在线| 久久久久久久久大av| 好男人在线观看高清免费视频| 18+在线观看网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产精品久久视频播放| 中文字幕av在线有码专区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久国内视频| 国产伦在线观看视频一区| av欧美777| 午夜免费激情av| av专区在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 青草久久国产| 欧美+日韩+精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日本一二三区视频观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产在线男女| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产探花极品一区二区| 天堂动漫精品| 国内精品久久久久久久电影| 欧美区成人在线视频| 色哟哟·www| 又爽又黄无遮挡网站| 黄色日韩在线| 九色成人免费人妻av| 国产69精品久久久久777片| 国语自产精品视频在线第100页| 日本精品一区二区三区蜜桃| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久精品91蜜桃| 舔av片在线| 精品久久久久久成人av| 日韩精品青青久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 丁香欧美五月| 最近在线观看免费完整版| 成人永久免费在线观看视频| 长腿黑丝高跟| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 此物有八面人人有两片| 国产精华一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产午夜福利久久久久久| 乱人视频在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日韩 亚洲 欧美在线| 757午夜福利合集在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 无遮挡黄片免费观看| 一本久久中文字幕| 黄色一级大片看看| 深爱激情五月婷婷| www.999成人在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国内精品一区二区在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩免费av在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 真人做人爱边吃奶动态| 香蕉av资源在线| 很黄的视频免费| av天堂中文字幕网| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久成人亚洲精品观看| 久久精品人妻少妇| 久久久久九九精品影院| 内射极品少妇av片p| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 男女之事视频高清在线观看| 国产色婷婷99| 男女下面进入的视频免费午夜| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩国内少妇激情av| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美极品一区二区三区四区| 波多野结衣高清无吗| 亚洲精华国产精华精| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产高清激情床上av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 婷婷精品国产亚洲av| 90打野战视频偷拍视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 热99在线观看视频| 性欧美人与动物交配| 亚洲精品在线美女| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲,欧美,日韩| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲国产精品久久男人天堂| av国产免费在线观看| 国产真实乱freesex| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美在线乱码| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产高清三级在线| 婷婷六月久久综合丁香| 色av中文字幕| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久午夜亚洲精品久久| 一级黄色大片毛片| 免费搜索国产男女视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲av一区综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 搞女人的毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av麻豆久久久久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美+亚洲+日韩+国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人a区在线观看| 欧美bdsm另类| 一级av片app| 日本免费一区二区三区高清不卡| 毛片女人毛片| 在线a可以看的网站| 国产伦人伦偷精品视频| 国产熟女xx| 久久精品影院6| 亚洲第一电影网av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产乱人视频| 久久久国产成人免费| 又紧又爽又黄一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 看十八女毛片水多多多| 91久久精品国产一区二区成人| 中文资源天堂在线| 舔av片在线| 99热精品在线国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 男女那种视频在线观看| 久久久久久久久大av| 午夜福利成人在线免费观看| 午夜福利18| 精品熟女少妇八av免费久了| 国内精品美女久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 亚洲色图av天堂| 18禁在线播放成人免费| 韩国av一区二区三区四区| 哪里可以看免费的av片| 国产色婷婷99| 长腿黑丝高跟| av在线老鸭窝| 99热只有精品国产| 国产 一区 欧美 日韩| eeuss影院久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 国产视频一区二区在线看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国内精品一区二区在线观看| 成人午夜高清在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产熟女xx| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩有码中文字幕| 成人美女网站在线观看视频| av天堂中文字幕网| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲avbb在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美高清性xxxxhd video| 91久久精品电影网| 69人妻影院| 免费黄网站久久成人精品 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 校园春色视频在线观看| 1000部很黄的大片| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲在线观看片| 波多野结衣高清无吗| 日本 欧美在线| 怎么达到女性高潮| 精品久久久久久,| 成人av在线播放网站| 91九色精品人成在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩免费av在线播放| 午夜免费激情av| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品一区av在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲自拍偷在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 首页视频小说图片口味搜索| 婷婷精品国产亚洲av| 宅男免费午夜| 亚洲欧美清纯卡通| 免费观看精品视频网站| 悠悠久久av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 色av中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 最好的美女福利视频网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产三级在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久久久久久久成人| 久久这里只有精品中国| 青草久久国产| 亚洲中文日韩欧美视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 99热精品在线国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日韩欧美在线二视频| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品影院6| 亚洲第一电影网av| 12—13女人毛片做爰片一| av视频在线观看入口| 一本精品99久久精品77| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 观看免费一级毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| av在线天堂中文字幕| 成人美女网站在线观看视频| 一个人看的www免费观看视频| 有码 亚洲区| 99久久精品国产亚洲精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲综合色惰| 国产精品伦人一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 欧美色视频一区免费| 亚洲av成人精品一区久久| 日本五十路高清| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久久久中文| 日日夜夜操网爽| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品av视频在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| 成年版毛片免费区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| 嫩草影院精品99| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 特级一级黄色大片| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品,欧美在线| 日本一二三区视频观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久香蕉精品热| 色哟哟·www| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久九九精品影院| 91九色精品人成在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 免费黄网站久久成人精品 | 能在线免费观看的黄片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 又爽又黄无遮挡网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 热99在线观看视频| 在线看三级毛片| 成人特级黄色片久久久久久久| 嫩草影院入口| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机福利观看| ponron亚洲| 91在线精品国自产拍蜜月| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | h日本视频在线播放| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜视频国产福利| АⅤ资源中文在线天堂| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利在线在线| 一区二区三区四区激情视频 | 9191精品国产免费久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 搡老岳熟女国产| 欧美xxxx性猛交bbbb| 网址你懂的国产日韩在线| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美潮喷喷水| 99热只有精品国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久亚洲真实| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 日本 欧美在线| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产不卡一卡二| 欧美3d第一页| 嫩草影视91久久| 久久久色成人| 午夜两性在线视频| 欧美黑人巨大hd| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美又色又爽又黄视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 又紧又爽又黄一区二区| 69av精品久久久久久| 国产熟女xx| 一个人免费在线观看的高清视频| 可以在线观看毛片的网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 高清在线国产一区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 如何舔出高潮| 少妇人妻一区二区三区视频| 很黄的视频免费| 好男人电影高清在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久这里只有精品中国| 精品国内亚洲2022精品成人| 我要搜黄色片| 动漫黄色视频在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| avwww免费| 中文字幕久久专区| 免费大片18禁| 国产老妇女一区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久人妻av系列| 嫩草影院精品99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费观看的影片在线观看| 国产三级中文精品| 日本在线视频免费播放| 亚洲内射少妇av| 99国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| av天堂在线播放| 久久伊人香网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 757午夜福利合集在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久人人精品亚洲av| 级片在线观看| 乱人视频在线观看| 全区人妻精品视频| 很黄的视频免费| 黄色女人牲交| 午夜日韩欧美国产| 精品久久久久久久末码| 亚洲 国产 在线| 人妻久久中文字幕网| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲欧美日韩东京热| 国产伦在线观看视频一区| 久久亚洲真实| 此物有八面人人有两片| 黄色丝袜av网址大全| 色综合站精品国产| h日本视频在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美性感艳星| 永久网站在线| 国产成人欧美在线观看| 免费高清视频大片| 亚洲欧美日韩东京热| 1024手机看黄色片| 最新中文字幕久久久久| 99热精品在线国产| 久久亚洲真实| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲无线在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费在线观看亚洲国产| 宅男免费午夜| 色5月婷婷丁香| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人a区在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 99热这里只有精品一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成年版毛片免费区| 99热6这里只有精品| 一区福利在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av成人精品一区久久| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美成人免费av一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 黄色一级大片看看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久中文看片网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美色视频一区免费| 亚洲美女视频黄频| netflix在线观看网站| 久久性视频一级片| 搡老岳熟女国产| 国产精品野战在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲真实伦在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av熟女| 神马国产精品三级电影在线观看| 又爽又黄a免费视频| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区三区高清视频在线| 高清在线国产一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品永久免费网站| 免费大片18禁| 日韩欧美 国产精品| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩欧美免费精品| 午夜福利高清视频| 天堂影院成人在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美三级亚洲精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲无线在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美极品一区二区三区四区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 极品教师在线免费播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产在视频线在精品|