磁性氧化鐵納米粒子的表面修飾及其在CTCs分離中應(yīng)用的研究進展*

黃小林 綜述 許恒毅 審校

隨著納米科學與技術(shù)的發(fā)展，納米粒子在不同研究領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。MIONs因具有高矯頑力、高磁敏性、非免疫原性、低毒性、較好的生物相容性等優(yōu)勢，受到越來越多研究者的親睞［1-2］。由于MIONs在藥物轉(zhuǎn)運［3］、磁成像［4-5］、組織修復(fù)［6］、糖尿病治療［7］、癌癥治療［8-9］及CTCs分離檢測［10-13］等生物醫(yī)學領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景，引起了各相關(guān)領(lǐng)域研究者的關(guān)注。一般方法合成的MIONs水溶性和生物相容性較差、易團聚且在血液循環(huán)中存在時間較短，往往無法直接滿足生物醫(yī)學應(yīng)用的要求［14］。因此，MIONs表面常需進行修飾和改性，以獲得更好的性能并引入合適的反應(yīng)功能基團（如羧基、羥基等）。在此基礎(chǔ)上，引入多種生物相關(guān)分子（抗體、靶向劑、藥物分子及熒光素等），實現(xiàn)MIONs的功能化。本文對MIONs的表面修飾及其在CTCs分離中的應(yīng)用進行綜述。

1 MIONs的表面修飾

MIONs粒徑一般在1～100 nm，絕大部分原子位于粒子的表面。疏水表面及比表面積較大因而具有特殊的表面性質(zhì)：1）NPs（nanoparticles）處于高能狀態(tài)，且表面吉布斯自由能較大，可自發(fā)地團聚、氧化或表面吸附，以降低能量；2）NPs表面存在許多活性中心，具有較高的化學活性；3）NPs表面臺階和粗糙度增加，表面出現(xiàn)非化學平衡、非整數(shù)配位的化學價。通?？蓪IONs進行表面修飾及改性，達到生物醫(yī)學應(yīng)用的要求。

1.1 MIONs表面修飾的方法

MIONs的表面修飾方法主要有原位反應(yīng)法（制備中修飾）和合成后表面改性法（制備后修飾）［15-16］。原位反應(yīng)法是指在納米粒子制備過程中直接加入表面修飾劑共同反應(yīng)，而合成后表面改性法是先制備出納米粒子，然后將其分散于表面修飾劑中進行包覆反應(yīng)。

1.2 MIONs表面修飾劑的種類及作用

用于MIONs表面修飾的材料有很多，主要包括聚合物、非聚合物和無機分子［15-16］。使用聚合物修飾可以提高MIONs生物相容性和膠體穩(wěn)定性，并引入反應(yīng)基團，常見的聚合物有聚乙二醇和聚乙烯醇等。使用非聚合物修飾MIONs可提高膠體分散性，常見為有機小分子和表面活性劑分子等。使用無機分子修飾可提高MIONs在液體中的穩(wěn)定性和抗氧化能力，且有利于生物配體的偶聯(lián)，常見的無機修飾分子有二氧化硅、金、金屬氧化物和硫化物等。

2 MIONs在CTCs分離中的應(yīng)用

CTCs是一類主要存在于癌癥患者外周血循環(huán)中的腫瘤源性上皮細胞，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)［17］。外周血中CTCs的出現(xiàn)往往早于臨床上可見實體瘤［18］。因此CTCs的精準診斷對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、腫瘤患者化療藥物的快速評估、個體化治療（臨床篩藥、耐藥性的檢測）、腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測以及腫瘤新藥物的開發(fā)等具有重要的指導(dǎo)意義，同時可為癌癥的有效防治提供理論參考。但是，早期腫瘤患者外周血中CTCs的數(shù)量十分稀少，在人體正常血液中，每數(shù)億個（4.0～5.5）×109/mL紅細胞中僅含（0～50）個CTCs，加上血液的性質(zhì)特殊（如粘稠、組分復(fù)雜等），導(dǎo)致CTCs完全“隱蔽”在外周血的復(fù)雜背景中，常規(guī)的手段還無法對其進行直接檢測［19-20］。目前CTCs的分離方法主要是基于細胞形態(tài)或細胞表面抗原/受體分子，已商業(yè)化的以免疫磁分離法應(yīng)用最為廣泛。

2.1 CellSearchTM系統(tǒng)

CellSearchTM系統(tǒng)由美國Veridex公司研發(fā)，是目前唯一通過美國FDA認證的半自動CTCs檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用的免疫磁珠是含單個納米鐵磁核，且包被了抗上皮細胞黏附因子（EpCAM）特異性抗體的納米磁顆粒，可特異性結(jié)合血液中所有表達Ep-CAM的CTCs，并在外加強力磁場下將CTCs從血液樣本中分離出來。臨床應(yīng)用CellSearchTM系統(tǒng)時，只需采集 7.5 mL 的血液樣本。Riethdorf等［21］利用 Cell-SearchTM檢測系統(tǒng)對92個轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血樣本（7.5 mL）中的CTCs進行分離檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)63個樣本中至少含有1個CTCs，而另外的29個樣本中未檢測到CTCs。在含CTCs的63個樣本中，34個樣本CTCs的數(shù)量在5個以上（CTCs cut-off值≥5 CTCs時與預(yù)后相關(guān)），13個樣本CTCs數(shù)量在50個以上（最多為1 491 CTCs）。

2.2 激活細胞分選系統(tǒng)

激活細胞分選系統(tǒng)（magnetic activated cell sorting system，MACS?）是由德國Miltenyi公司研發(fā)的利用MACS微珠捕獲細胞的專用產(chǎn)品，該產(chǎn)品因操作簡便、快速（2.5～30 min）、高純度（90%～99%）、高回收率等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于CTCs的分離。MACS微珠由氧化鐵組成且表面修飾了多聚糖。K?nigsberg等［22］使用MACS?正向選擇性分離轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血中EpCAM陽性CTCs，證明EpCAM陽性細胞（MCF-7及ZR-75-1）的回收率明顯高于EpCAM陰性細胞（Hs587T）。26個臨床確診為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血樣本中，發(fā)現(xiàn)含CTCs的概率為42.3%。同時該研究將MACS?與另外一種不依賴于EpCAM密度離心分離法OncoQuick?plus進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分離EpCAM陽性細胞時前者的回收率明顯高于后者，相反在分離EpCAM陰性細胞時后者的回收率高于前者。

2.3 AdnaTestTM系統(tǒng)

AdnaTestTM是由德國AdnaGen AG公司開發(fā)用來分離和檢測血液中CTCs的系統(tǒng)。AdnaTestTM系統(tǒng)使用磁性微球來分離患者外周血樣本中表達有相關(guān)抗原的CTCs，基于RT-PCR技術(shù)檢測表達有相關(guān)特異性基因的腫瘤細胞。該磁性微球表面修飾了抗上皮抗原的抗體（抗EpCAM抗體）和抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體（抗MUC1抗體）。相對CellSearchTM系統(tǒng)（需7.5 mL血液樣本），臨床應(yīng)用AdnaTestTM系統(tǒng)時，只需采集5 mL血液樣本。Andreopoulou等［23］同時使用AdnaTestTM與美國Veridex公司研發(fā)的CellSearchTM對55個轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的外周血樣本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CellSearchTM的CTCs陽性率為47%（CTCs cutoff值≥2 CTCs）和36%（CTCs cutoff值≥5 CTCs）；而AdnaTestTM的CTCs陽性率為53%。上述兩種檢測系統(tǒng)的陽性一致率為73%（CTCs cutoff值≥2 CTCs）和69%（CTCs cutoff值≥5 CTCs）。

2.4 Dynal Magnetic Beads?材料

Dynal Magnetic Beads?是由美國Invitrogen公司生產(chǎn)，用于細胞分離的免疫磁分離類產(chǎn)品，已取得美國環(huán)保局和美國分析化學家協(xié)會（AOAC）的認證。Dynal Magnetic Beads?由γ-Fe2O3和Fe3O4磁性材料合成，是一種超順磁、單分散性多聚微球，其表面修飾有一層用于吸附和結(jié)合生物活性分子的多聚材料。Dynal Magnetic Beads?用于細胞分離主要有以下優(yōu)點：1）全部過程可在試管內(nèi)完成，不需要磁柱及離心操作；2）可根據(jù)實驗需要選擇不同的分離方法；3）獲取的目標物質(zhì)純度及產(chǎn)量較高；4）對后續(xù)分析無抑制作用而不需洗脫。Talasaz等［24］將1 000 CEpCs（circulating epithelial cells）加標于9 mL PBS溶液中，通過Dynal Magnetic Beads?選擇性捕獲1 h后使用分離器分離，CEpCs的分離效率達50%。該研究對52個外周血樣本（9 mL）又進行分離，發(fā)現(xiàn)在健康者的樣本中并未分離到CEpCs，而47個轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血樣本均檢測到CEpCs，其數(shù)量為（12±23）個。

2.5 EasySep?技術(shù)

EasySep?是由加拿大StemCell公司開發(fā)的一種新型而高效的免疫磁珠細胞分選技術(shù)。EasySep?的理論基礎(chǔ)為靶細胞表面特異性的抗原抗體反應(yīng)，其實現(xiàn)靶細胞高純度分離則基于StemCell公司四聚體復(fù)合物（TAC）技術(shù)。需要富集的靶細胞通過TAC與磁微粒相結(jié)合后在EasySep?專用磁極提供的磁場中即可與非靶細胞相分離。EasySep?所用的磁微粒極小，不會影響靶細胞的后續(xù)分析，因此不需要去除，具有簡單快捷（25 min）、獲得細胞純度高（達99%）、回收率高、對細胞無影響等優(yōu)點。Fusi等［25］應(yīng)用EasySep?分離了68個腫瘤患者外周血樣本（10 mL）中的CTCs，結(jié)果顯示72%（49/68）的樣本至少分離到1個CTCs。

2.6 基于磁性納米粒子的其他分離方法

隨著新型納米材料和表面修飾材料的不斷出現(xiàn)，越來越多基于納米粒子的磁分離方法被建立并用于CTCs的分離。如Xu等［11］利用熱分解法在有機溶劑十八烯中，以氧化鐵粉為前體、油酸為配體，成功制備了表面修飾有雙親聚合物的MIONs。該MIONs直徑為30 nm，具有良好的生物相容性且可利用其表面的羧基來偶聯(lián)癌細胞相關(guān)抗體。該研究將MIONs表面的羧基與抗HER-2抗體上的氨基偶聯(lián)并用于外周血中癌細胞的分離，可以分離出平均73.6%的SK-BR-3細胞（最大為84%）。

3 結(jié)語與展望

20世紀70年代以來，MIONs已受到國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注，有關(guān)其制備、表面修飾或改性及應(yīng)用的研究論文層出不窮。MIONs作為一種磁性強、制備相對簡單、且生物相容性較好的磁性納米材料，已被廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學領(lǐng)域。在CTCs的分離和腫瘤的治療方面，MIONs起著至關(guān)重要的作用，具有極大的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。為此，除了MIONs自身合成需不斷改進外，MIONs的表面修飾或改性的完善也是未來研究的重點。相信隨著高分子材料學、磁學、醫(yī)學、生物工程學的進一步發(fā)展，MIONs相關(guān)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究必將也加速發(fā)展，從而為臨床上CTCs的分離檢測和腫瘤的早期診斷及治療提供新的契機。

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