基于量子點標記探針技術的腫瘤分子分型研究進展*

方 敏 彭春偉 陳 創(chuàng) 龐代文 李 雁

基于量子點標記探針技術的腫瘤分子分型研究進展*

方 敏①彭春偉①陳 創(chuàng)②龐代文③李 雁①

李雁 教授，醫(yī)學博士，博士生導師，主任醫(yī)師，現(xiàn)任武漢大學珞珈學者特聘教授，武漢大學腫瘤研究所所長，為教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃及湖北省政府特殊津貼獲得者。美國臨床腫瘤學會會員，中國抗癌協(xié)會納米腫瘤技術專業(yè)委員會常委，Biomaterials雜志（IF=7.882）副主編。主要從事消化道腫瘤的外科綜合治療，尤其是腹膜癌的綜合治療和基于納米熒光探針技術的腫瘤微觀分子影像學研究。主持國家自然科學基金重點項目和面上項目5項，承擔國家重大科技專項2項。發(fā)表SCI論文88篇，影響因子累計超過280?？蒲谐晒@全國優(yōu)秀博士論文（2004年），國家科技進步一等獎（2006年），美國臨床腫瘤學會IDEA獎（2008年），湖北省科技進步一等獎（2011年）。

惡性腫瘤在分子水平上具有高度異質性，是個體化治療的依據(jù)。發(fā)展同時顯示腫瘤原位多分子指標的技術對研究腫瘤生物學行為至關重要。量子點標記探針技術因其具有獨特的光學和化學特性，在腫瘤診斷、監(jiān)測、治療、發(fā)病機制、分子分型及異質性研究中均有廣闊應用前景。本文總結該技術在腫瘤分子分型方面的應用進展。

量子點 腫瘤 分子分型 多色成像

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多階段漸進的過程，腫瘤異質性使不同個體對治療反應迥異。因此，根據(jù)腫瘤不同生物學行為特征建立腫瘤分子分型，以此確定相應的腫瘤個體化治療策略，是臨床腫瘤學的重要發(fā)展方向［1］。

1 分子分型的概念及其意義

腫瘤分子分型（molecular classification）系采用高通量分子分析技術，根據(jù)分子遺傳學或分子生物改變特征，使腫瘤的分類由主要依賴形態(tài)學轉向以分子特征為基礎的新分類系統(tǒng)［2］；分子分型可不依賴于組織形態(tài)學鑒定，卻可對后者進行有效補充。長期以來，組織病理學在腫瘤分型中一直處于主導地位，但臨床實踐日益顯示，普通病理形態(tài)學已不能滿足臨床需要。以乳腺癌為例，以TNM分期系統(tǒng)為基礎的分類體系，一直是乳腺癌綜合治療的主要依據(jù)［3］。該體系以病理形態(tài)學為基礎，綜合考慮腫瘤大?。═）、淋巴結狀態(tài)（N）、有無遠處轉移（M），在一定程度上揭示了乳腺癌的生物學行為特征。盡管如此，臨床實踐表明同一病理類型、同一分期的惡性腫瘤患者，采用同一治療方案，其療效及預后可能有明顯不同，說明該法尚不能全面展現(xiàn)乳腺癌發(fā)展演變過程中所蘊含的重要信息。個體化醫(yī)療為目前乳腺癌診療的主要方向，而準確的腫瘤分子分型對判斷腫瘤組織學來源、鑒別組織學亞型、預測腫瘤復發(fā)轉移風險、選擇個體化治療策略等均至關重要［4］，迫切需要發(fā)展原位、定量、多分子同時分析技術，建立適應腫瘤個體化治療需求的綜合性分子分型體系。

2 量子點的物理特性及應用優(yōu)勢

分子成像技術是21世紀最重要的高新技術之一，基于納米材料標記的分子探針技術在癌癥診斷和治療方面具有廣闊的應用前景［5］。尤其是量子點（Quantum dots，QDs）標記分子探針技術在細胞分子成像及定量檢測分析方面有顯著優(yōu)勢［6］。量子點是一種直徑在1～10 nm的半導體納米晶粒。核（CdSe/CdS/CdTe）殼（ZnS）結構量子點可與一系列生物靶標包括蛋白質、抗體、核酸、親和體等結合形成分子探針，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，具有以下優(yōu)勢：1）連續(xù)而寬的激發(fā)光譜，物理尺寸和組份比例可調性；2）可同時進行多色標記，檢測靈敏度高；3）抗光漂白能力強；4）熒光強度高而穩(wěn)定；5）生物相容性好，抗組織自發(fā)熒光干擾能力強；6）摩爾熒光量子產率高等。這些優(yōu)點突破了傳統(tǒng)熒光材料探針局限，已在腫瘤的分子成像、細胞成像和在體成像研究中取得重要進展［7］。同時，目前的基因組學、蛋白質組學等檢測手段主要是對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵分子進行定性、半定量研究，尚不能原位、實時展現(xiàn)關鍵分子與臨床關鍵信息的相互作用關系，因此難以準確全面揭示腫瘤進展演變的規(guī)律，以及在宏觀形態(tài)上實現(xiàn)對腫瘤侵襲行為的綜合評估［8］。多分子成像技術有望突破這一技術障礙，有利于實現(xiàn)細胞或組織水平的原位、實時、定量、多組分、長時程成像，同時結合快速發(fā)展的生物信息學技術，快速有效準確地提取、挖掘和分析成像信息，為發(fā)展個體化診療提供全新的技術支撐平臺。

3 量子點標記分子探針成像技術在腫瘤分子分型中的應用

盡管組織病理長期以來為腫瘤診斷的金標準，但已無法滿足腫瘤個體化治療需求；而且，腫瘤大體組織及病理形態(tài)并非總存在特異和典型的改變；因此，分子層面的變化及特點顯得更為實用且有效［9］。量子點標記的分子探針技術能對腫瘤特異性標志物實現(xiàn)原位、實時、定量、高靈敏度成像，為腫瘤分子分型提供有效的技術手段。

3.1 量子點標記探針原位單分子成像及定量檢測

量子點在腫瘤分子分型中的應用范例是乳腺浸潤性導管癌中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的檢測。HER2是表皮生長因子受體家族成員，參與腫瘤增生、血管形成和轉移，準確定位、定量并全面解析其生物學行為，對乳腺癌個體化治療至關重要［10］。Wu等［11］利用量子點標記技術成功實現(xiàn)了HER2的靶向檢測。Yezhelyev等［12］也實現(xiàn)了在不同細胞系及臨床組織標本中的HER2檢測，并證實HER2準確定量在臨床實踐中的應用價值，為個體化診療提供依據(jù)。我們課題組也開展了量子點標記探針對乳腺癌HER2靶向診斷應用基礎研究［7，13-16］（圖1）。首次在乳腺癌臨床病理標本中實現(xiàn)了HER2的靶向特異性檢測，評估了量子點標記分子探針的可靠性、靈敏性與實用性，初步證實了該技術的體外定量檢測優(yōu)勢［13］。隨后，進一步在大樣本乳腺癌隨訪患者中評估了該體系的價值，基于多光譜技術進一步提高了HER2檢測的準確性和可靠性，實現(xiàn)了傳統(tǒng)形態(tài)病理學關鍵指標腫瘤大小與HER2定量參數(shù)的整合，提出了乳腺癌HER2總量的概念。結果表明，用HER2總量來評估HER2狀態(tài)，與目前檢測金標準具有較高的一致性，可以較好地揭示乳腺癌HER2表達的生物學規(guī)律，可以甄別出目前傳統(tǒng)方法難以發(fā)現(xiàn)的乳腺癌新亞型。以此來指導的乳腺癌分子靶向治療，有望進一步提高乳腺癌療效，推動乳腺癌的個體化、規(guī)范化治療［15］。最近，通過對激素受體的定量與定性分析，建立了基于激素受體表達的亞型分類新標準，并聯(lián)合HER2總量新指標，實現(xiàn)了乳腺癌亞型預后差異的有效預測［16］。

除了在乳腺癌研究中的應用外，Li等［17］利用量子點標記分子探針聯(lián)合多光譜分析技術實現(xiàn)了對人前列腺癌Akt-1的定量檢測，高通量組織芯片分析表明，高表達Akt-1與患者高特異性復發(fā)及死亡風險密切相關，該研究證實了量子點標記分子探針的定量檢測優(yōu)勢。最近，Zhao等［18］基于量子點標記分子探針技術，實現(xiàn)了胃癌中Caveolin-1的定量檢測，預測胃癌預后。

3.2 量子點標記探針原位多分子共成像

基于量子點標記探針多分子成像技術在個體化評估腫瘤生物學行為、鑒別診斷、分期分型及治療方案制定等方面意義更大（表1）。Ghazani等［19］利用該技術對肺癌組織芯片進行多分子成像，結合計算機信息獲取及計算方法，成功建立肺癌中三種關鍵蛋白表達信息的綜合分析方法，為肺癌的診斷和治療提供了新思路。Snyder等［21］利用該技術，對乳腺癌組織切片的三種標記分子CD44、CD24和Ki67進行原位多色成像，結果表明，在CD44和CD24亞組中，Ki67陽性率是不同的，這為不同亞組采取不同的治療手段提供依據(jù)。

Liu等［22］也利用該技術成功建立了霍奇金淋巴瘤的分子分型方法。Reed-Sternberg（RS）細胞是病理診斷霍奇金淋巴瘤的標志，但其數(shù)量只占了淋巴組織中異質性浸潤淋巴細胞的1%，診斷困難?；诹孔狱c多色成像技術通過原位同時顯示組織切片中的CD15、CD30、CD45和Pax5四種分子，可快速將霍奇金淋巴瘤中的少量異質性RS細胞（CD15+/CD30+/CD45-/Pax5+）從大量淋巴細胞中鑒別出來。該診斷技術已應用于臨床轉化研究，包括6例霍奇金淋巴瘤，2例可疑淋巴瘤和2例良性淋巴結增生。因此，基于量子點多色成像的腫瘤分子分型技術，有望提高對異質性RS細胞的檢測靈敏度，提高霍奇金淋巴瘤的診斷分型準確度。

圖1 量子點標記探針技術在分子病理中的應用Figure 1 QD-based immunohistochemistry（IHC）labeled the molecular pathology

表1 基于量子點多分子成像技術的腫瘤分子分型研究Table 1 Molecular classification of tumors using quantum dot-based multiplexed imaging

3.3 量子點標記探針對腫瘤微環(huán)境的分子分型研究

1889年Paget提出“種子和土壤學說”，器官微環(huán)境可影響特定腫瘤細胞的存活、生長和侵襲。本課題組也開展了基于腫瘤微環(huán)境分析的胃癌分子分型研究（圖2）?；诹孔狱c標記分子探針技術，對腫瘤微環(huán)境關鍵分子進行原位多色成像，包括間質的主要成分Ⅳ型膠原，間質降解主要成分MMP9，免疫浸潤細胞的代表巨噬細胞以及腫瘤新生血管標志CD105，揭示了腫瘤細胞與微環(huán)境的協(xié)同進化過程，提出微環(huán)境的5種特征［8，23-24］，并將腫瘤侵襲模式分為4種類型［23］。同時，根據(jù)間質巨噬細胞的浸潤程度，腫瘤新生血管的數(shù)量及新生血管的成熟度等三大特點，提出間質微環(huán)境特征分子分型概念，據(jù)此將胃癌分為4種亞型，各組間的臨床預后具有顯著差異［24］。并且，不同的胃癌病理類型呈現(xiàn)的腫瘤微環(huán)境差異顯著，由浸潤性巨噬細胞、腫瘤新生血管及腫瘤細胞構成的轉移單元在低分化胃癌中顯著多于高分化胃癌［25］。

另外，基于量子點多分子成像技術的肝細胞癌微環(huán)境研究結果顯示，Ⅳ型膠原在腫瘤組織中分布具有異質性，并根據(jù)間質微環(huán)境差異總結出以下三方面特征［8］：1）相比于癌旁及肝硬化組織，肝癌細胞外間質中的主要成分Ⅳ型膠原由于機械應力的作用變得僵直并且缺乏彈性；2）膠原在降解之前，將發(fā)生壓縮和重塑，與腫瘤新生血管的形成同時進行；3）膠原在侵襲的前鋒部位被降解，而剩余的未被降解部位的膠原呈線性排列，圍繞著癌巢與血管。上述工作表明，在開展腫瘤分子分型時，既要關注腫瘤細胞本身，也要分析間質微環(huán)境，后者的類型特征是腫瘤預后預測體系的必要部分。

圖2 癌癥侵襲過程中腫瘤微環(huán)境的5種組織學特征Figure 2 Five histopathologic characteristics of tumor microenvironment during tumor invasion

4 結語

腫瘤是多基因參與的復雜疾病，具有多階段性發(fā)展的特點［8］。因此腫瘤研究模式也必須不斷發(fā)展：從單基因向多基因、從單一層次向集成層次、從單種細胞向多種細胞轉變，多維信息的獲取和分析技術則是實現(xiàn)這一轉變的先決條件。量子點標記探針多色成像技術和多光譜分析技術，為基于多分子差異表達的腫瘤分子分型提供了較好的平臺，有望在指導腫瘤個體化治療方面發(fā)揮重要作用。

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（2013-09-27收稿）

（2013-11-15修回）

Research progress on the molecular classification of tumors by quantum dot-based nanotechnology

Min FANG1,Chunwei PENG1,Chuang CHEN2,Daiwen PANG3,Yan LI1

Yan Li;E-mail:liyansd2@163.com
1Department of Oncology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors and Hubei Cancer Clinical Study Center,Wuhan 430071,China.
2Department of Breast and Thyroid Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China.
3College of Chemistry and Molecular Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China.

Malignant tumors are highly heterogeneous in terms of molecular phenotypes such that personalized therapy will become the standard for tumor therapy.Molecular classifications of cancer based on differences in biological behavior are important for selecting treatment strategies and prognostication.The unique optical and chemical properties of quantum dots have been widely used in biomedical applications such as tumor diagnosis,monitoring,pathogenesis,treatment,molecular pathology,and heterogeneity based on biological markers.In this study,we discuss the application of quantum dot-based nanotechnology and the molecular classification of cancer in personalized oncology.

quantum dots,tumor,molecular classification,multiplexed imaging

10.3969/j.issn.1000-8179.20131857

①武漢大學中南醫(yī)院腫瘤科，湖北省醫(yī)學臨床研究中心，腫瘤生物學行為湖北省重點實驗室（武漢市430071）；②武漢大學人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科；③武漢大學化學與分子科學學院

*本文課題受國家自然科學基金面上項目（編號：81171396）、重點項目（編號：81230031/H18）和國家科技重大專項（編號：2012ZX10002012-12）資助

李雁 liyansd2@163.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171396,81230031/H18)and the National Science and Technology Major Project(No.2012ZX10002012-12).

（本文編輯：鄭莉）