細胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學*

詹啟敏 陳 杰

惡性腫瘤最基本的生物學特征是腫瘤細胞失控性增殖，而細胞失控性增殖的生物學基礎是細胞周期調(diào)控紊亂。細胞周期調(diào)控是一個精細的生物學過程，涉及了多個基因和蛋白的參與，進而形成了復雜的信號分子網(wǎng)絡系統(tǒng)。因此，了解細胞周期及其相關(guān)基因的表達可以從基礎生物學研究的角度深入發(fā)掘腫瘤的本質(zhì)，闡明癌癥的發(fā)生機制，并為腫瘤的早期診斷提供標記分子。此外，細胞周期蛋白的深入研究還能夠為設計特異性抑制腫瘤細胞生長的藥物和發(fā)展個體化的臨床治療方案提供理論基礎，為選擇特異性藥物靶點、優(yōu)化治療措施提供科學基礎。

1 細胞周期相關(guān)基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及意義

細胞周期調(diào)控機制與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，許多抑癌基因如 p53、BRCA1、Rb、p16、p15 以及 p53、BRCA1的下游調(diào)控基因如p21、Gadd45是細胞周期監(jiān)測點的重要組成部分。但在腫瘤發(fā)生過程中，這些抑癌基因多有基因改變而失活，造成細胞周期監(jiān)測點功能缺陷。

監(jiān)測點的功能缺陷將導致各種錯誤被帶入細胞周期，例如DNA復制錯誤和染色體分離紊亂等，并造成基因組的不穩(wěn)定性。基因組的不穩(wěn)定性通常表現(xiàn)為基因突變、基因缺失，基因重排和易位，以及中心體擴增和染色體畸形?；蚪M不穩(wěn)定性將導致基因組紊亂程度進一步惡化，其結(jié)果是細胞周期制動機制（監(jiān)控機制）失活并伴隨細胞周期驅(qū)動機制強化，從而產(chǎn)生細胞失控性增殖，導致腫瘤的發(fā)生。所以，腫瘤發(fā)生的重要原因是細胞周期調(diào)控機制的破壞。

2 癌相關(guān)基因在腫瘤細胞周期調(diào)控過程中的生物學作用

腫瘤抑癌基因p53和BRCA1在細胞增殖、分化以及凋亡等多種生命活動中發(fā)揮重要作用。本課題組與其他研究團隊研究顯示，p53和BRCA1的最重要生物學功能之一是參與細胞周期調(diào)控。p53和BRCA1功能的紊亂導致細胞周期調(diào)控機制的失控，進而造成基因組的不穩(wěn)定性，最終導致腫瘤細胞形成和惡性增殖。p53和BRCA1蛋白是轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)許多基因表達，通過下游基因，參與細胞周期的調(diào)控［1］。p53在細胞周期運轉(zhuǎn)的多個環(huán)節(jié)起到重要作用，當某個細胞的染色體DNA在G1期受到損傷時，p53轉(zhuǎn)錄活性增強，誘導p21基因的激活，進而使p21抑制細胞周期依賴激酶（CDK）的活性，阻止細胞的進一步增殖。而當損傷信號進入S期時，由p53誘導的p21可在復制叉處連接DNA聚合酶復合體，并阻止其活性，誘導細胞的修復。此外，p53還能通過誘導其他基因和蛋白的活性來加強對細胞周期的阻滯作用，如14-3-3σ等。如果染色體DNA的損傷過于嚴重，p53就會啟動凋亡。

視網(wǎng)膜母細胞瘤基因產(chǎn)物Rb是一個重要的抑癌基因。Rb與Cyclin D、CDK4及p16等分子相互作用，抑制細胞周期的運轉(zhuǎn)。在腫瘤細胞中，Rb基因缺失，導致細胞周期的紊亂，進而促進腫瘤細胞的惡性增殖。此外，Rb也參與了細胞周期的調(diào)控，其磷酸化程度與細胞周期的進程一致。當G1期起始時，Cyclin D/CDK4復合體形成，Rb起始磷酸化，磷酸化的Rb釋放與其結(jié)合并抑制的蛋白，如E2F家族成員。E2F刺激了包括Cyclin E在內(nèi)的G1/S期基因的表達，這些分子促進細胞通過G1/S期監(jiān)測點，使細胞周期進入S期。但當細胞DNA受到損傷，高表達的p21抑制Cyclin D/CDK4對Rb的磷酸化，使Rb處于去磷酸化狀態(tài)，其結(jié)合E2F家族成員，阻止了E2F調(diào)控的G1/S期基因表達，細胞阻滯在G1期（G1/S期監(jiān)測點）。Gadd45亦在DNA損傷時細胞周期監(jiān)測點的調(diào)控、DNA修復和細胞凋亡過程中起到重要的作用。

2.1 Gadd45在腫瘤細胞周期中的生物學作用及意義

Gadd45表達通過BRCA1和p53的影響，進而參與細胞周期的調(diào)控。近年來本課題組著重研究了p53/Gadd45通路和BRCA1/Gadd45通路在調(diào)控細胞周期G2/M監(jiān)測點和中心體（centrosome）復制中的分子機制，以揭示細胞增殖失調(diào)與腫瘤惡性生長的內(nèi)在聯(lián)系。其機制主要有以下4點：1）Gadd45是在細胞DNA受到損傷或細胞接受生長阻滯信號時被誘導的一種基因，也是在世界上首次報道的P53蛋白調(diào)控的靶基因［2］。研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45蛋白依賴于正常p53分子的功能，進而在細胞周期G2/M監(jiān)測點調(diào)控中發(fā)揮重大作用。近一步的研究表明，Gadd45通過與Cdc2激酶相互作用，進而導致Cdc2/Cyclin B1復合物解離并改變Cyclin B1的亞細胞定位，從而抑制Cdc2激酶的活性，形成細胞周期G2/M期介導的生長阻滯（即G2/M監(jiān)測點）［3］。此外，激活的Gadd45蛋白通過ERK信號通路反饋性誘導P53蛋白穩(wěn)定性增強。2）探討了Gadd45蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)運過程及其相關(guān)的機制。Gadd45是一種無核定位信號（nuclear localization signal）的核蛋白，可能是通過一種特殊的核轉(zhuǎn)運機制被其他載體蛋白帶入核內(nèi)。目前的研究顯示，這種載體蛋白（分子伴侶蛋白）可能是核仁磷酸蛋白B23/NPM［4］。3）Gadd45 和中心體復制相關(guān)的激酶 Aurora-A有直接的相互作用。由于Aurora-A激酶的過度激活可以導致中心體擴增和染色體畸形，推斷并證明Gadd45在維持中心體穩(wěn)定性的生物學功能是通過抑制Aurora-A激酶的活性來體現(xiàn)的［5］。4）分析BRCA1調(diào)控Gadd45基因的分子生物學機制。證明BRCA1對Gadd45的調(diào)控是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平，BRCA1調(diào)控Gadd45基因的活性位點是在Gadd45的啟動子上［6］。但p53對Gadd45基因的調(diào)控是通過直接結(jié)合Gadd45第3個內(nèi)含子來進行的。由于BRCA1目前還不能被證實是一個能夠結(jié)合特異DNA位點的轉(zhuǎn)錄因子，本課題組研究發(fā)現(xiàn)BRCA1對Gadd45基因的調(diào)控是通過2個可與Gadd45啟動子直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1和NF-YA相互作用而體現(xiàn)的。這項研究工作極大地拓寬了BRCA1在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的生物學功能［7］。

2.2 Nlp在腫瘤細胞周期中的生物學作用及意義

本課題組研究發(fā)現(xiàn)了一個與BRCA1有直接相互作用且共定位于中心體的新蛋白Nlp（ninein like protein）。Nlp在中心體的定位以及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可能依賴于BRCA1的正常功能，突變的BRCA1或沉默內(nèi)源性BRCA1均會破壞其在中心體的共定位關(guān)系以及Nlp的降解。抑制內(nèi)源的Nlp會導致異常紡錘體的形成、染色體分離失敗、胞質(zhì)分裂失敗以及染色體的非整倍性［8-9］。

人乳腺癌和肺癌中研究顯示，Nlp過表達可能與Nlp基因的擴增有關(guān)。Nlp表現(xiàn)出較強的癌基因特性，可以轉(zhuǎn)化NIH3T3成纖維細胞。更有重要意義的是Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠的表型與缺失BRCA1正常功能的表型相似，包括中心體擴增和自發(fā)腫瘤［10］。可見，Nlp可能是BRCA1調(diào)控細胞分裂的重要蛋白分子，在有絲分裂過程中發(fā)揮作用，Nlp的異常可以導致基因組不穩(wěn)定和腫瘤發(fā)生。本課題組最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nlp的異常高表達明顯降低紫杉醇對乳腺癌細胞的殺傷作用，直接影響到臨床乳腺癌患者的療效［11］。

3 細胞周期分子與臨床診斷及腫瘤治療

細胞周期調(diào)控的正常進行以及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，鑒定參與調(diào)控細胞周期各個環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)群并且評價這些蛋白質(zhì)群在調(diào)控細胞周期的各個階段、維持基因組穩(wěn)定性中的作用機制以及蛋白質(zhì)群之間的相互作用對于腫瘤研究至關(guān)重要。其中，Cyclins和CDKs所構(gòu)成的細胞周期時鐘復合體以及其相應的抑制分子CKIs（cyclin kinase inhibitor）功能的紊亂在多種腫瘤被發(fā)現(xiàn)，因此了解Cyclins/CDKs/CKIs軸在各型腫瘤中的表達及研究其相應的生物學功能對于臨床早期診斷惡性腫瘤和有效防治腫瘤具有重大的意義和價值。

3.1 Cyclin B1與腫瘤預后判斷、個性化治療的關(guān)聯(lián)及相應的基礎研究

Cyclin B1蛋白在細胞周期中呈時相性表達，在G2/M期時表達達到峰值，并與CDK1結(jié)合形成復合體，啟動有絲分裂，進而誘導G2/M期的轉(zhuǎn)變。Cyclin B1表達的紊亂能夠?qū)е录毎芷谶\行的失控及細胞惡性轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤中，如食管鱗癌、肺癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、直腸癌、肝癌、腎癌及胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)了Cyclin B1的過表達。Cyclin B1過表達的機制可能與原癌基因c-myc、H-Ras等誘導的啟動子活性增強，mRNA穩(wěn)定性增加及p53介導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)。Cyclin B1過表達可作為腫瘤惡性進展的指征，對判斷多種鱗狀細胞癌，如食管鱗癌、肺鱗癌和舌癌等患者預后及生存率有著重要的意義。利用反義寡核苷酸等方法特異性地抑制多種腫瘤細胞中Cyclin B1基因的表達，能夠顯著地抑制這些腫瘤細胞的惡性增殖，說明Cyclin B1作為臨床腫瘤治療靶點的應用價值。此外，乳腺癌患者中BRCA1基因缺陷時常伴有Cyclin B1/CDK1復合體功能亢進。因此，在乳腺癌的治療過程中，除了判斷BRCA1基因的缺失與否，檢測Cyclin B1的表達情況對乳腺癌的個性化治療起到了重要的作用。雖然大量臨床研究顯示了Cyclin B1與腫瘤的關(guān)聯(lián)性，但是對于Cyclin B1誘導腫瘤惡性進展的機制卻知之甚少。本課題組研究首次證實了Cyclin B1在腫瘤細胞的過度表達能夠誘導腫瘤細胞向特定器官轉(zhuǎn)移。進一步研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細胞中過表達的Cyclin B1能夠?qū)е录毎膼盒栽鲋澈颓忠u轉(zhuǎn)移，特別是透過微血管內(nèi)皮向肺組織侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強。抑制食管鱗癌細胞中過表達的Cyclin B1能夠顯著抑制食管鱗癌的生長和對肺組織的靶向性轉(zhuǎn)移。其分子機制研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin B1誘導侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強與激活NF-κB信號通路介導的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)［12］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Cyclin B1能夠通過激活PI3K/AKT信號通路，參與食管鱗癌化療藥耐藥的產(chǎn)生，進一步證實了Cyclin B1作為腫瘤治療藥物靶點的重要意義［13］。

3.2 Aurora-A與腫瘤預后判斷、個性化治療的關(guān)聯(lián)及相應的基礎研究

Aurora激酶家族分為3個成員：Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C，主要調(diào)節(jié)中心體和微管的功能。其中Aurora-A在G2/M期轉(zhuǎn)變、中心體分離、紡錘體裝配以及胞質(zhì)分裂中扮演了重要的角色。在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌，肝癌、胰腺癌、食管鱗癌及胃癌等臨床研究中Aurora-A均過表達。Aurora-A過表達的機制可能與其基因組擴增，進而導致中心體異常以及p53分子的突變及Aurora-A本身在腫瘤組織中存在的基因多態(tài)性有關(guān)。在胃癌、結(jié)腸癌及頭頸腫瘤等臨床研究中Aurora-A的基因拷貝數(shù)均過度增加。Aurora-A的基因多態(tài)性能夠誘導其激酶活性的增強，更易出現(xiàn)非整倍體細胞，并與絕經(jīng)后婦女患乳腺癌的風險性呈正相關(guān)［14］。Aurora-A基因與蛋白在非小細胞肺癌組織中表達明顯高于鄰近正常組織，并且其表達情況與TMN分級、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處器官轉(zhuǎn)移、復發(fā)和家族史等都存在明顯的相關(guān)性［15］。進一步研究其機制，發(fā)現(xiàn)Aurora-A在不同非小細胞肺癌細胞系中的表達程度與其DNA拷貝數(shù)有關(guān)［16］。針對此機制，在非小細胞肺癌中通過Aurora-A特異性抑制劑能夠抑制多種非小細胞肺癌細胞系的惡性生長。此外，Aurora-A的蛋白表達量與腎母細胞瘤的臨床分期關(guān)系密切，針對Aurora-A活性的抑制劑在臨床前期腎母細胞瘤的治療過程中顯示了良好的應用前景。基于這些認識，開發(fā)Aurora-A的特異性抑制劑能夠為腫瘤個性化治療提供一種新的策略。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A能夠與抑癌基因AP-2α相互結(jié)合，進而降低AP-2α的穩(wěn)定性并通過蛋白酶體促進其降解，進一步豐富了Aurora-A在誘導腫瘤發(fā)展過程中的生物學機制［17］。研究還發(fā)現(xiàn)，Aurora-A過表達能夠提高食管鱗癌細胞的增殖、黏附及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并增強裸鼠的致瘤能力和對周圍組織的侵襲能力，與食管鱗癌的臨床病理分級存在明顯的相關(guān)性。利用siRNA干擾Aurora-A的表達后發(fā)現(xiàn)，抑制Aurora-A表達能夠使食管鱗癌細胞的生長和侵襲能力顯著降低。從另一個角度發(fā)現(xiàn)了Aurora-A在食管鱗癌中的促腫瘤功能并證實Aurora-A作為食管鱗癌預后判斷的獨立因素和抗腫瘤藥物靶點開發(fā)的潛在價值［18］。此外，還發(fā)現(xiàn)Aurora-A能夠誘導Bcl-2的活性，進而產(chǎn)生化療藥耐藥性，進一步豐富了Aurora-A的生物學功能和該蛋白的臨床應用價值［19］。

3.3 Cyclin D與腫瘤預后判斷、個性化治療的關(guān)聯(lián)及相應的基礎研究

Cyclin D家族分為3個亞型：Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3。其中Cyclin D1的研究最為廣泛，在正常組織中，Cyclin D1不表達或者表達較低，而在腫瘤組織中，Cyclin D1經(jīng)常出現(xiàn)基因擴增，基因重排及突變，導致基因產(chǎn)物增多。在胃癌、乳腺癌、淋巴瘤、原發(fā)性肝癌等臨床研究中Cyclin D1表達陽性率明顯高于正常組織。此外，抑制頭頸腫瘤及非小細胞肺癌中高表達Cyclin D1的活性顯示了良好的腫瘤抑制作用。反義寡核苷酸Cyclin D1能夠抑制Cyclin D1的活性，進而增強卡鉑在多種腫瘤中的生長抑制效果，這些研究為腫瘤的治療提供了新的靶點［20-21］。

3.4 Cyclin E與腫瘤預后判斷及個性化治療的關(guān)聯(lián)

Cyclin E能夠控制細胞周期進入S期，常被視為S期的標志物，Cyclin E介導的G1/S期決定和限速作用在細胞周期的運轉(zhuǎn)過程中起到中心調(diào)控作用。Cyclin E過表達主要由其基因擴增所誘導，這些過表達的Cyclin E能夠形成大量畸形的中心體，有利于細胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤惡性增殖。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、膀胱癌及白血病等臨床研究中Cyclin E均過度表達。因此，Cyclin E在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的癌基因角色越來越被學者們認同，在臨床上逐漸被作為一種獨立或者聯(lián)合指標用來判斷疾病進展程度和患者預后［22-24］。

3.5 p16與腫瘤預后判斷及個性化治療的關(guān)聯(lián)

p16基因又稱為多腫瘤抑制基因（multi-tumor suppressor gene，MTS1）。該基因定位于9號染色體短臂，主要抑制CDKs的活性，起到分子剎車的作用。在多種腫瘤中，如肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，p16基因出現(xiàn)較高頻率的功能缺失性突變。胃癌、肝癌及非小細胞肺癌等臨床研究中p16基因缺失。作為功能與p16相類似的抑癌基因p14也能夠起到細胞周期阻滯的作用。但是p14作用機制與p16不同，不與CDK激酶結(jié)合，主要通過誘導MDM2從核質(zhì)向核仁轉(zhuǎn)位，進而使p53在核質(zhì)中積累導致p53的穩(wěn)定性增強［25-26］。在許多人類腫瘤細胞中，如肺癌、白血病、黑色素瘤及肝癌等細胞中p14基因均出現(xiàn)了缺失性突變。這種p14基因的缺失性突變也能夠被作為判斷腫瘤患者預后的臨床指征。通過腺病毒將p16基因?qū)敕伟⑷橄侔┘鞍螂装┘毎?，能夠造成細胞周期阻滯，進而抑制腫瘤細胞的生長，為腫瘤的靶向基因治療提供了策略和思路。

3.6 p21與腫瘤預后判斷及個性化治療的關(guān)聯(lián)

p21是最先發(fā)現(xiàn)的CKI基因，定位于6號染色體短臂21.2。作為一種抑癌基因，p21通過與多個Cyclin/CDK復合體結(jié)合，進而抑制其活性，在細胞周期的多個時相起到阻滯作用。此外，p21的C端還有增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合域，與PCNA結(jié)合后使之不能與DNA聚合酶形成復合物，阻止DNA全酶復合物在DNA單鏈上滑動，抑制DNA復制。多種腫瘤中存在著p21的多態(tài)性突變，導致p21難以抑制Cyclin/CDK復合體的形成［27-28］。p27與p21有較高的同源性，亦能夠與多種Cyclin/CDK結(jié)合并抑制其活性。近年來，p27在腫瘤中的異常表達與腫瘤惡性增殖的關(guān)系受到廣泛重視，在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肺癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤中p27的表達水平下降［29-31］。因此，p21、p27基因的功能缺失性突變和多態(tài)性突變都能夠被用來作為判斷腫瘤患者預后。將外源性p21基因通過基因克隆的方法轉(zhuǎn)染入慢性粒細胞白血病細胞系中能夠顯著抑制細胞的惡性增殖，并誘導細胞凋亡。

3.7 細胞周期分子與腫瘤治療

放療和化療是治療惡性腫瘤最重要的手段，但腫瘤細胞對放療產(chǎn)生耐受及對化療藥物產(chǎn)生耐藥常常最終導致放化療失敗。腫瘤細胞的細胞周期監(jiān)測點缺陷有可能是增加放化療治療效果的希望所在。細胞周期監(jiān)測點缺陷的腫瘤細胞對電離輻射和某些抗癌藥物十分敏感。其機制是監(jiān)測點缺陷的腫瘤細胞在放射線和化療藥物引起DNA損傷后，不能正常行使監(jiān)測點功能，細胞周期不能停滯，修復機制不被啟動，而細胞周期強行通過時啟動了細胞凋亡機制，從而更容易使細胞死亡。基于此研究理論，目前開發(fā)的多種消除細胞周期G2監(jiān)測點功能的藥物，如咖啡堿和UCN-01等，能增加放射線的治療作用?？梢?，細胞周期監(jiān)測點缺陷既是腫瘤發(fā)生的根本原因，又是研制特異性腫瘤治療的靶點。闡明細胞周期相關(guān)分子及其相應機制可以為臨床腫瘤治療藥物和特異的治療方案提供理論基礎，達到有效治療惡性腫瘤的目的。

近年來，各種組學研究的迅速發(fā)展和生物信息學的利用使化療藥物作用機制等方面的研究獲得了突破性進展。分析化療藥物對腫瘤細胞殺傷效應與特定基因的表達和/或多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，選擇合適的藥物進行個體化治療，已經(jīng)成為提高療效、減少無效治療的合理選擇。腫瘤組織中多種靶標基因mRNA表達水平可以用來預測患者對多種常用化療藥物的反應。此外，對于細胞周期相應分子的基因表達情況及多態(tài)性研究也日益豐富。了解這些基因表達及多態(tài)性情況對選擇有針對性的藥物及其劑量，開展個性化治療，提高治療效果起到了重要的作用。

4 細胞周期分子與藥物設計

4.1 作用于細胞周期的抗腫瘤藥物

細胞周期的異常運轉(zhuǎn)是腫瘤細胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，其中S期的DNA合成和G2/M期的細胞有絲分裂對維持腫瘤細胞的惡性增殖尤為重要。各種抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的生長抑制大都體現(xiàn)在對于細胞周期這2個時相的調(diào)控上。因此，針對這2個時相以及相應藥物的研究對于了解細胞周期和化療藥的相互關(guān)系起到重要的作用。1）作用于S期化療藥物主要有喜樹堿和氟尿嘧啶。喜樹堿作為從中國珙桐科植物喜樹中分離出來的化合物能夠通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）活性，進而抑制DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，使細胞阻滯在S期。喜樹堿在多種腫瘤，如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、直腸癌、乳腺癌及皮膚癌等中具有抗腫瘤活性。氟尿嘧啶是一類廣譜的抗腫瘤藥物，在腫瘤細胞中氟尿嘧啶轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，并與還原型四氫葉酸及胸腺嘧啶核苷酸合成酶結(jié)合，使胸腺嘧啶核苷酸合成酶失活，進而抑制S期的DNA合成，達到抗腫瘤的效果。2）作用于G2/M期化療藥物主要有紫杉醇和長春新堿。紫杉醇作為臨床常用的化療藥能夠用來治療多種實體瘤，如肺癌、胃癌、肝癌、頭頸腫瘤、食管鱗癌等。通過破壞微管的聚合，使腫瘤細胞阻滯在G2/M期，導致Cyclin/CDK復合體，特別是Cyclin B1/CDK1復合體難以形成，最終阻止細胞的有絲分裂，促進腫瘤細胞的凋亡。另外，長春新堿亦可通過作用于微管，抑制微管聚合進而使細胞阻滯于G2/M期，進而對多種腫瘤，如胃癌、肝癌、小細胞肺癌等起到殺傷作用。

4.2 基于Aurora-A、Cyclin B1及MDM2的化療藥物開發(fā)

基于大量前期研究并結(jié)合本課題組研究成果，Aurora-A、Cyclin B1及MDM2有望作為新型細胞周期分子靶點，用于化療藥物的開發(fā)。其中，Aurora-A靶向小分子化合物（MLN8054）能夠競爭性結(jié)合Aurora家族成員中ATP結(jié)合位點抑制Aurora，特別是Aurora-A的激酶活性。其機制主要與MLN8054抑制Aurora-A T288位點的自磷酸化有關(guān)。此外，MLN8054誘導腫瘤細胞的凋亡作用能夠在多種p53缺陷性的腫瘤細胞中產(chǎn)生，進一步說明了MLN8054能夠不依賴于p53的作用抑制腫瘤生長。PHA-680632作為與MLN8054功能相類似的小分子化合物，在臨床前實驗中已被證實可用于多種腫瘤細胞系，并且其半數(shù)抑制率已達到nM級。此外，PHA-680632還能夠增敏放療在腫瘤治療過程中的效果，證實了PHA-680632能夠聯(lián)合其他抗腫瘤方案的療效。喹啉噻唑啉酮類化合物（RO-3306）能夠競爭性結(jié)合CDK1中ATP結(jié)合位點，抑制Cyclin B1/CDK1復合體的功能，誘導G2/M期阻滯，進而導致多種腫瘤細胞的凋亡。MDM2通過與野生型p53相互拮抗，進而起到癌基因的作用。通過分子對接及進一步活性篩選實驗發(fā)現(xiàn)的一些抑制MDM2-p53結(jié)合的小分子化合物，如苯二氮平類、螺-吲哚酮類、Nutlin-3等均在臨床前細胞實驗中顯示了良好的腫瘤抑制效果。

4.3 天然產(chǎn)物及單克隆抗體對腫瘤細胞周期的作用

目前正在臨床應用或者處于臨床前研究的多種抗腫瘤藥物，如一些天然產(chǎn)物及單克隆抗體等均具備了一定的細胞周期抑制作用。因此，研究這些藥物的細胞周期調(diào)節(jié)作用，對于理解藥物的抗腫瘤藥理機制及效應起到了重要的作用。其中多種生物堿類、黃酮類及萜類天然產(chǎn)物能夠作用于細胞周期各個時相，進而起到抗腫瘤作用。如苦參堿能夠使肝癌細胞系和慢性粒細胞白血病細胞系阻滯于S期，同時抑制端粒酶活性，進而抑制細胞生長。此外，從檳榔樹果中提取的檳榔堿能夠使口腔上皮癌細胞系阻滯于G2/M期，起到細胞毒作用。水飛薊素能夠通過提高CKIs，特別是p21的活性，進而抑制Cyclin D/CDK4復合體的功能，使腫瘤細胞的細胞周期阻滯于G1期。異黃酮類能夠在低劑量時使細胞阻滯于G2/M期，高劑量時使細胞阻滯于S期，進而抑制多種腫瘤細胞生長。萜類化合物棉子酚能夠使腫瘤細胞的細胞周期阻滯于S期，而多萜類及半萜類化合物能夠抑制多種腫瘤細胞的G1期。

雖然目前無特異性針對細胞周期分子的單克隆抗體，但是多種酪氨酸激酶受體抑制劑能夠抑制各種生長信號及激酶受體本身對下游促細胞周期分子特別是對CDKs的激活效應，進而間接地起到細胞周期阻滯作用。

4.4 基于CDKs的小分子化合物開發(fā)

當前CDKs抑制劑開發(fā)的方向主要針對CDKs-ATP結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的高度保守性，采用分子對接及相應的高通量篩選等技術(shù)獲得小分子化療藥物。主要的CDKs小分子抑制劑主要分為以下3類：嘌呤衍生物、Flavopiridols及Paullones。1）嘌呤衍生物主要包括6-二甲基-氨基嘌呤、Isopentenyladenine、Olomoucine、Roscovitine及其衍生物等。其中，6-二甲基-氨基嘌呤是第1代CDKs抑制劑，其作用靶點為CDK1，但其作用特異性不高。第2代和第3代嘌呤的衍生物（Isopentenyladenine和 Olomoucine）對CDKs的作用強度及選擇性均較強，但是其半數(shù)抑制濃度仍停留在μM級。第4代衍生物Roscovitine是對Olomoucine進行進一步結(jié)構(gòu)改造的產(chǎn)物，對CDK1及CDK2激酶抑制活性半數(shù)抑制濃度值值達到了nM級。由于Roscovitine對腫瘤細胞的增殖有較高的抑制作用以及副作用較小，目前已經(jīng)進入Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗。2）Flavopiridol是一種源于植物的黃酮類化合物，從樹皮中提取出純化合物，對其進行結(jié)構(gòu)改造，人工合成了一系列衍生物。臨床前研究顯示，F(xiàn)lavopiridol具有廣譜的CDKs抑制活性，其中對CDK1、CDK2及CDK4激酶活性的抑制作用尤其明顯［32-33］。盡管Flavopiridols對腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，但由于其對正常細胞毒性較為嚴重，因此開發(fā)與之藥理作用相近但正常細胞毒性較少的CDKs抑制劑成為必然，在對其結(jié)構(gòu)進行改進后獲得了Paullones衍生物。3）Paullones類化合物對CDK1和CDK2及CDK5有特異性的抑制作用，其中，Alsterpaullone和Kenpaullone對CDKs激酶的半數(shù)抑制濃度均已達到nM級，且毒性作用較低。因此，基于細胞周期調(diào)控分子CDKs在腫瘤發(fā)生中的重要作用，CDKs抑制劑的開發(fā)成為腫瘤治療的新亮點。

5 結(jié)語

本文以細胞周期為核心，系統(tǒng)分析了細胞周期對腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學影響，及相應的臨床診斷和藥物治療的意義。為深入了解惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，尋找有效的腫瘤診斷、治療靶點和制定治療方案提供新的思路和理論依據(jù)。

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