32P膠體體外誘導顱咽管瘤細胞凋亡*

常洪波 高 銘 王淑為 趙思源 盧旺盛 于 新 田增民 張劍寧

32P膠體體外誘導顱咽管瘤細胞凋亡*

常洪波①高 銘②王淑為①趙思源①盧旺盛①于 新①田增民①張劍寧①

目的：探討32P膠體對顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）體外培養(yǎng)細胞誘導凋亡作用及劑量效應和時間效應關系。方法：通過原代細胞培養(yǎng)獲得CP有限傳代細胞系，經不同濃度32P膠體處理不同時間后，應用MTT比色法繪制細胞存活率曲線。流式細胞儀定量檢測細胞凋亡率。Hoechst 33342熒光染色檢測凋亡細胞形態(tài)。TUNEL熒光染色檢測DNA特征改變。透射電子顯微鏡（TEM）檢測細胞超微結構。結果：Hoechst 33342熒光染色、TUNEL熒光染色、TEM均證實32P膠體確能引起CP細胞產生凋亡。隨著32P膠體處理濃度（0～14.80 MBq/mL）及時間（1～14 d）的增加，CP細胞存活率減少、凋亡率增高。結論：32P膠體能明顯抑制CP體外培養(yǎng)細胞生長并誘導凋亡，劑量越大及處理時間越長其殺傷作用越強。

顱咽管瘤 細胞培養(yǎng) 凋亡 磷-32

顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）經初次開顱手術切除后復發(fā)率為9%～51%，平均時間26～96個月，再次開顱手術患者往往難以耐受［1-2］。本科自1985年應用立體定向32P膠體內放療治療囊性CP，成功治療患者1 200余例［3］。32P膠體是否引起CP細胞發(fā)生快速凋亡和（或）遲發(fā)性凋亡，或引起CP組織營養(yǎng)血管內皮細胞或周圍成纖維細胞的凋亡、壞死，使CP細胞失營養(yǎng)而發(fā)揮治療作用尚不得知。32P膠體是否在低劑量輻射條件下利用凋亡途徑殺傷腫瘤細胞，而高劑量輻射直接引起細胞壞死，既往鮮見相關報道。驗證32P膠體導致的凋亡機制、劑量效應和時間效應關系對治療劑量選擇和治療方案優(yōu)化等有重要意義。因此，本研究建立了CP的有限傳代細胞株，用32P膠體處理CP體外培養(yǎng)細胞，觀察其誘導細胞凋亡變化，探討其可能的機理，建立劑量效應和時間效應關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

32P膠體即磷酸鉻（32P-chromic phosphate，32P-CP）膠體注射劑，由中國原子高科股份有限公司生產。表皮生長因子、1 mg/mL膠原酶、0.25%胰蛋白酶/0.05%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及高糖改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自美國Gibco公司；MTT、Hoechst 33342熒光試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V（annexin V-fluorescein iso-thiocyanate，Annexin-V-FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、青霉素均為美國Sigma公司產品。末端脫氧核苷酸轉移酶標記（terminal deoxynucleotidyl transferase［TdT］-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒為美國Vazyme公司產品。廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）及鼠二步法免疫組織化學試劑盒為北京中杉金橋公司產品。

1.2 方法

1.2.1 CP細胞原代培養(yǎng) 新鮮CP手術切除組織塊來源于本科手術患者，術后病理證實為牙釉質型。采用顯微鏡下組織修剪、胰酶差速貼壁消化法結合機械刮除法建立CP有限傳代細胞系。采用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況及細胞形態(tài)，Pan-CK（1：500）免疫組織化學染色鑒定。將傳代第2代呈對數(shù)生長期細胞用不同初始放射性活度的32P膠體進行不同照射時間處理后行后續(xù)檢測。

1.2.2 實驗方法與分組 取對數(shù)生長期的CP細胞，接種2×106個/孔單細胞懸液于6孔板內，培養(yǎng)24 h并貼壁后分為對照組與處理組。處理組分別加入使用生理鹽水稀釋的100 μL初始放射性活度為1.85、3.70、7.40、14.80、29.60 MBq的32P膠體，每孔加藥后用培養(yǎng)液調整總體積為2 mL，5組初始放射性濃度分別為0.925、1.850、3.700、7.400、14.800 MBq/mL；陰性對照組則加入100 μL的冷膠體，空白對照組為100 μL的生理鹽水。分別于處理1、3、5、9、14 d后進行樣本檢測，各組每孔均設5個復孔取其均值。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞存活情況 各組細胞處理后用細胞酶標儀在490 nm測定各孔吸光度值（optical density，OD），取各孔吸光度的平均值。存活率分析為當前存活率=同一濃度處理組OD值均值/陰性對照組OD值均值×100%，設陰性對照組存活率為100%。以濃度為橫軸、細胞存活率為縱軸繪制不同天數(shù)的細胞存活率曲線。

1.2.4 FCM檢測凋亡率 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細胞及陰性對照組CP細胞1×105個/mL各取2 mL，4℃離心，1 500 r/min×10 min，棄上清，重復PBS洗滌操作1次，細胞重懸后分別加入10 μL Annexin-V-FITC及5 μL PI，反應后立即行FCM檢測，同時對陰性對照組進行檢測。FCM激發(fā)光波長用488 nm，波長515 nm檢測FITC熒光，波長560 nm檢測PI熒光，數(shù)據用MultiCycle分析軟件處理，計算兩組凋亡率并進行比較。

1.2.5 凋亡細胞的Hoechst 33342熒光檢測 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細胞爬片及陰性對照組細胞爬片加入少量Hoechst 33342染色液，覆蓋住樣品即可，室溫放置3～5 min，吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗滌2～3次，3～5 min/次。直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6TUNEL熒光染色觀察 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細胞爬片及陰性對照組細胞爬片，用4%多聚甲醛固定細胞30～60 min，加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后使用激發(fā)波長為450～500 nm，發(fā)射波長為515～565 nm，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 TEM檢測凋亡亞細胞形態(tài)學改變 消化收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細胞，細胞計數(shù)1×105～1×107個，1 500 r/min離心15 min，4%甲醛固定后按常規(guī)程序處理行TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據采用SPSS 17.0軟件進行分析，凋亡率的比較用χ2檢驗，計量資料結果用±s表示，組間比較用方差分析，處理組與陰性對照組比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測細胞存活率曲線結果

原代培養(yǎng)CP細胞生長良好，最長可傳代6代，生存45 d，Pan-CK免疫組織化學染色鑒定為陽性結果符合CP細胞特征（圖1），成功建立了CP有限傳代細胞系。光鏡下觀察CP細胞為不規(guī)則形，連接成片，呈鋪路石狀，可見核分裂期細胞，核結構完整，胞漿透明，無明顯顆粒，空泡樣結構。經32P膠體處理后細胞隨著濃度及時間的增加，可見細胞增殖逐漸減緩，出現(xiàn)固縮死亡情況。將傳代第2代呈對數(shù)生長期細胞用不同初始放射性活度的32P膠體進行照射不同時間處理后，MTT比色法檢測繪制細胞存活率曲線，可見隨著處理濃度的增加細胞存活率明顯降低；隨著處理時間的延長細胞存活率明顯降低（圖2）。不同濃度32P膠體處理1、3、5、9、14 d組OD值方差分析結果比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；處理組分別與陰性對照組比較，除處理1 d的0.925 MBq/mL處理組與0 MBq/mL陰性對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）以外，其他各組與0 MBq/mL陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

2.2 FCM檢測凋亡率比較結果

3.700 MBq/mL作用3 d處理組凋亡率為38.1%，陰性對照組凋亡率為5.5%（均包括早期及晚期凋亡），經比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

2.3 Hoechst 33342熒光染色檢測細胞形態(tài)學結果

處理組細胞核藍色深染，形態(tài)不規(guī)則，體積變小，染色質濃縮、碎裂、邊緣化，可見特征性凋亡小體（圖4A）。陰性對照組CP細胞核大小較一致，染色質藍色熒光分布較均勻，細胞形態(tài)規(guī)整（圖4B）。

表1 32P膠體處理CP細胞不同時期各組OD值±s，n=5Table 1 Optical density of CP cells in each group treated with32P colloid for different times（±s，n=5）

Time（d）Concentration（MBq/mL）1 3 5 9 1 4 0 0.31±0.05 0.43±0.05 0.60±0.02 0.77±0.02 1.00±0.02 0.925 0.29±0.05 0.38±0.05a0.51±0.02a0.60±0.05a0.73±0.02a1.850 0.26±0.01a0.34±0.01a0.44±0.03a0.53±0.05a0.60±0.05a3.700 0.21±0.02a0.26±0.01a0.32±0.02a0.36±0.04a0.32±0.03a7.400 0.18±0.02a0.21±0.01a0.25±0.02a0.27±0.05a0.26±0.02a14.800 0.15±0.01a0.18±0.01a0.19±0.01a0.22±0.01a0.21±0.02aaP＜0.05 vs 0MBq/mL，with statistical significance

2.4 TUNEL熒光染色觀察結果

處理組CP細胞呈現(xiàn)綠色熒光特征的陽性表現(xiàn)，表明經處理后發(fā)生了凋亡改變（圖4C）。對照組僅見少量綠色熒光顯色，無凋亡發(fā)生（圖4D）。

2.5 TEM檢測亞細胞凋亡形態(tài)結果

處理組CP細胞出現(xiàn)細胞核染色質固縮、核密度增高，細胞變小并核碎裂，胞漿中出現(xiàn)空泡樣結構；可見凋亡細胞經核碎裂后形成的染色質塊（核碎片），且細胞有發(fā)芽、起泡，處于脫落成球形內含細胞質、細胞器和核碎片的凋亡膜包小體早期改變（圖5A）。正常CP細胞呈多角形，核內染色質分布較均勻，核膜清晰；胞漿豐富，線粒體、內質網、核糖體清晰；細胞膜不規(guī)則，有凸起（圖5B）。

3 討論

目前國內外對CP的基礎研究仍少，本實驗為首次應用32P膠體處理CP體外培養(yǎng)細胞后檢測其誘導凋亡作用及劑量效應和時間效應關系。研究的前提是建立CP細胞可長期穩(wěn)定傳代存活的有限傳代細胞系，國內外已有學者成功建立了CP有限傳代細胞系［4-6］。本研究通過對新鮮切除的腫瘤組織標本采用顯微鏡下修剪、胰酶差速貼壁消化法結合機械刮除法實現(xiàn)了對CP細胞的分離純化及有限地連續(xù)傳代培養(yǎng)，并經過免疫組織化學染色鑒定腫瘤細胞角蛋白陽性表達。CP細胞的倍增時間為3～5 d，細胞對數(shù)期生長可維持2～3 w，成功傳代第2代及第3代的細胞株生長較穩(wěn)定，可進行凍存和復蘇處理，為本實驗使用的穩(wěn)定細胞株。本實驗培養(yǎng)的CP細胞經病理證實為釉質上皮型，其穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)成功率高。

適合CP囊內治療的藥物主要分為化學治療藥物及放射治療藥物。國內外有報道用維甲酸、博萊霉素、干擾素α（interferon alpha，IFNα）等化學藥物臨床應用或實驗處理體外培養(yǎng)的CP細胞觀察療效，但均具有敏感性不強及毒副反應大等缺點，目前臨床應用不多［7-9］。Cáceres等［9］總結了既往博萊霉素應用于囊性CP治療情況后認為其抑制囊液分泌效果好，但也有部分病例產生了神經毒性反應情況。因其半衰期較短，往往需要短時間多次用藥控制囊性復發(fā)，且其本身滲漏后對神經系統(tǒng)毒副反應較大，近幾年相關報道較少。Kickingereder等［10］總結了博萊霉素與IFNα的作用后認為其不如β射線核素藥物更安全有效，并推薦應用32P膠體。Cavalheiro等［11］應用IFNα治療CP結果提示，60例患者的多中心研究報道平均隨訪44個月，腫瘤控制率為78%，僅有少量相關的不良反應：頭痛（10%）、水腫（8%）、發(fā)熱（8%）以及容易疲勞（2%）。相對于博萊霉素和32P膠體，IFNα無相關神經毒性副作用及明顯禁忌證，但到目前為止，IFNα的研究經驗有限［12］。Blackburn等［13］認為理想的放射治療藥物應具有產生純β射線、作用范圍局限、半衰期短等特點，可使用磷-32（32P）、釔-90（90Y）、錸-186（186Rh）、金-198（198Au）。Trippel等［14］總結了多種放射治療藥物的應用情況，比較了32P和90Y的特點。目前國內外主要以應用32P膠體內放療為主。本實驗選用的32P-CP膠體為無菌、綠色溶液，核純度＞99.9%，pH為7.0，化學濃度為2.32 mg/mL，放射性濃度≥1 850 MBq/mL。32P是純β衰變核素，β射線的最大能量為1.711 MeV，半衰期為14.3 d，輻射距離8～12 mm，因其臨床安全性及效果肯定而廣泛應用。細胞在射線作用下產生增殖抑制、細胞凋亡，與射線的劑量水平和物理特性之間存在一定的相關性。有報道［15］在一定劑量率條件下對實驗動物和體外培養(yǎng)細胞實施低劑量水平的照射可以誘導動物和細胞的適應性反應及興奮效應，早期表現(xiàn)為細胞增殖明顯活躍。其分子機理可能是DNA的損傷與修復同時發(fā)生，當用低劑量照射時其水平顯著提高，從而發(fā)生細胞短暫興奮性現(xiàn)象（1～3 d），之后才發(fā)生遲發(fā)相凋亡。這與本實驗MTT法測到的數(shù)據統(tǒng)計結果符合。本研究采用的劑量率范圍基本涵蓋了臨床32P膠體治療的劑量范圍，但由于實驗條件及觀察時間限制，對細胞的遠期殺傷效果及細胞壞死遠期損傷程度觀察不夠。此外未進行單劑量照射與多次劑量照射的實驗比較。

凋亡作為一種可調控的細胞死亡方式在腫瘤放射治療中的作用日益受到重視。惡性程度較高的細胞其凋亡發(fā)生在幾個小時之內，表現(xiàn)為快速凋亡，而對CP等增殖較慢的細胞，通常為幾天之內發(fā)生的遲發(fā)性凋亡。雖然用凋亡判斷輻射效應的價值仍有爭議，但本實驗證實32P膠體確可引起CP細胞出現(xiàn)較高的凋亡率并明顯抑制其增殖，最終引起細胞的死亡。目前臨床上常用多次照射方案，主要因患者CP囊性復發(fā)后再次引起壓迫癥狀，需要再次抽吸囊液減壓并行內放療抑制腫瘤增殖。但是多次照射最佳間隔時間很難確定。臨床上多因CP復發(fā)后再次引起癥狀時才行二次內放療手術，一般間隔3個月以上。首次照射后最敏感細胞先被殺傷，隨后出現(xiàn)短期細胞修復的放射抗性階段，隨著時間的延長，細胞周期再分布，重新恢復了放射的敏感性，并且初次照射后也影響細胞的DNA修復系統(tǒng)導致再次照射后細胞修復能力減弱，可認為多次照射效果更好。本實驗表明隨著照射劑量的增加及時間的延長，細胞的殺傷作用逐漸增強。據此，臨床上本研究推薦在保證手術及照射相對安全的情況下，早期給予間斷、足量內放療對于CP細胞殺傷效果更好，同時考慮到有發(fā)生延遲性凋亡的可能性，在無癥狀和體征等明確復發(fā)的情況下不建議貿然進行二次內放療手術。雖然CP的臨床治療方法較多，但爭議較大，公認以手術全切為主。除了開顱手術之外，對于手術殘余及復發(fā)的實性腫瘤可以補充放射治療。隨著近年對32P膠體囊內放療治療CP的臨床開展及基礎研究的深入，其不失為一種較好的控制囊性復發(fā)性CP的方法。目前CP的發(fā)生、病因、病理及細胞生物學仍不十分明確，加強其細胞、分子水平的研究，找尋影響預后的因素，改進臨床治療措施勢在必行［16］。穩(wěn)定的CP腫瘤胞系和動物模型的建立已經為后續(xù)實驗研究奠定了基礎。對于隸屬良性腫瘤，卻呈惡性表現(xiàn)的CP來說，若獲得良好治療效果尚需要廣大研究學者的齊心耕耘。

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（2014-02-10收稿）

（2014-04-10修回）

（本文編輯：邢穎）

32Pcolloid induced apoptosis of craniopharyngioma cells in vitro

Hongbo CHANG1,Ming GAO2,Shuwei WANG1,Siyuan ZHAO1,Wangsheng LU1,Xin YU1,Zengmin TIAN1,Jianning ZHANG1
Correspondence to:Jianning ZHANG;E-mail:jnzhang2005@163.com

1Institute of Neurosurgery,Navy General Hospital,Navy Clinical Medical School of the Second Military Medical University,Bei

jing 100048,China;2Bayi Children's HospitalAffiliated to General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

Objective:This study aimed to investigate the possible mechanism of32P colloid induced apoptosis of craniopharyngioma(CP)cells in vitro and the relationship between dose effect and time effect.Methods:This study established a primary cell culture of CP limited subculture cell line.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to plot the cell survival curve after the CP cells were treated with32P colloid at different concentrations and time.Apoptotic rate was detected by flow cytometry(FCM).Apoptosis related DNA was investigated by TUNEL fluorescent staining.The morphological characteristics of apoptotic cells were determined by Hoechst33342 fluorescence staining.The ultrastructure of apoptotic cells was investigated by transmission electron microscopy(TEM).Results:Hoechst33342 fluorescence staining,TUNEL fluorescence staining,and TEM revealed that32P colloid induced the apoptosis of CP cells.32P colloid reduced the survival rate and increased the apoptotic rate of CP cells as concentration(0 MBq/mL to 14.80 MBq/ mL)and time(1 d to 14 d)were increased.Conclusion:32P colloid could effectively inhibit the growth of CP cells and induce apoptosis in vitro.High concentrations and prolonged time could induce a remarkable effect.

craniopharyngioma,cell culture,apoptosis,phosphorus-32

10.3969/j.issn.1000-8179.20140197

常洪波 醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。研究方向為顱咽管瘤及膠質瘤的基礎和臨床研究。

①第二軍醫(yī)大學海軍臨床醫(yī)學院海軍總醫(yī)院神經外科研究所（北京市100048）；②北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院

*本文課題受首都醫(yī)學發(fā)展科研基金（編號：2009-2053）資助

張劍寧 jnzhang2005@163.com

E-mail：changhongbo2000@gmail.com