LTA對(duì)BALB/c幼鼠腸黏膜TLR4表達(dá)的影響

，(.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形外科，湖南 衡陽(yáng) 400；.湖南省環(huán)境生物學(xué)院生物化學(xué)教研室)

LTA對(duì)BALB/c幼鼠腸黏膜TLR4表達(dá)的影響

周昌寧1，曹海寧2
(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形外科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南省環(huán)境生物學(xué)院生物化學(xué)教研室)

目的探討脂磷壁酸(LTA)對(duì)BALB/c幼鼠腸黏膜Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的影響。方法將30只1周齡BALB/c幼鼠隨機(jī)分為正常組、溶媒組和LTA組，分別給予NS、DMSO和LTA各0.1 mL一次性灌胃處理，并于處理后第1周、第2周和第4周分別取幼鼠回腸末端、回盲部及結(jié)腸組織，HE染色觀察各段組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果HE染色顯示與正常組相比，溶媒組和LTA組幼鼠腸黏膜組織均有炎性浸潤(rùn)尤以經(jīng)LTA處理后第1周的回腸末端最明顯：其黏膜結(jié)構(gòu)完整性受損，黏膜間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量細(xì)胞氣球樣變性甚至壞死。免疫組化結(jié)果表明各組不同組織不同時(shí)間段均表達(dá)TLR4;LTA組表達(dá)量最高，與正常組和溶媒組相比差異均有顯著性(P<0.05)；各組同一組織TLR4表達(dá)隨時(shí)間延遲表達(dá)量增多以第4周最高，與第1周和第2周相比差異有顯著性(P<0.05)；相同組織在不同組別以結(jié)腸表達(dá)最高并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P<0.05)；第4周LTA組結(jié)腸組織表達(dá)量最高，差異均有顯著性(P<0.05)。結(jié)論LTA能上調(diào)腸黏膜TLR4表達(dá)并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其對(duì)LTA識(shí)別和反應(yīng)部位可能主要位于結(jié)腸。

脂磷壁酸； 腸黏膜； 二甲基亞砜； TLR4

腸道是人體最大的免疫器官[1]，在機(jī)體防御和清除外來(lái)抗原中起著重要作用。腸道免疫系統(tǒng)的主要組成部分是腸黏膜免疫[2]，現(xiàn)已逐漸發(fā)展成一門(mén)獨(dú)立的學(xué)科，其研究領(lǐng)域含蓋先天性免疫和獲得性免疫等方面。腸道細(xì)菌總數(shù)達(dá)1014以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)體細(xì)胞數(shù)量1013，這些腸道細(xì)菌通過(guò)表達(dá)病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)來(lái)被先天性免疫系統(tǒng)中的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)所識(shí)別[3]。新生兒腸道是無(wú)菌的，腸黏膜免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育，隨著腸道菌群的定植，腸道黏膜免疫系統(tǒng)逐步發(fā)育完善，因而腸道菌群被認(rèn)為是腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟的始動(dòng)因素。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫系統(tǒng)中的一類(lèi)重要的PRRs，TLRs通過(guò)與PAMP結(jié)合啟動(dòng)腸黏膜免疫[4]，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分泌各種趨化因子和細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮抗感染免疫作用，因而被認(rèn)為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在腸黏膜免疫中一般認(rèn)為T(mén)LRs家族中TLR4與共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及腸道共生菌的耐受相關(guān)。目前對(duì)腸黏膜免疫的研究主要集中于革蘭氏陰性細(xì)菌及其細(xì)胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[5]，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及其細(xì)胞壁成分LTA在黏膜免疫中的作用報(bào)道較少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄球菌脂磷壁酸(LTA 5 mg/支) 購(gòu)自Sigma公司，用DMSO配成0.1 mg/mL溶液。DMSO 由南華大學(xué)免疫與微生物教研室惠贈(zèng)。免疫組化相關(guān)試劑：TLR4單克隆抗體鼠購(gòu)自 Abgent公司，SP免疫組化試劑盒DBA顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將30只1周齡BALB/c幼鼠隨機(jī)分為三組：正常組、溶媒組和LTA組，每組10只，分別給予NS(陰性對(duì)照)、DMSO(溶媒對(duì)照)和LTA 0.1 mL一次性灌胃處理并于處理后第1周、第2周、第4周取出幼鼠回腸末端、回盲部、結(jié)腸，HE染色觀察各段組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)情況。在每張免疫組化切片中隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)的視野(×200)，采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，分析同時(shí)相點(diǎn)各個(gè)視野TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的積分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 回腸末端黏膜組織學(xué)變化

正常組BALB/c幼鼠回腸末端可見(jiàn)絨毛結(jié)構(gòu)且絨毛細(xì)而短，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞；回盲部可見(jiàn)淋巴濾泡、淋巴小結(jié)及彌散淋巴組織；結(jié)腸內(nèi)未見(jiàn)絨毛但在固有層內(nèi)可見(jiàn)散在的結(jié)腸腺。溶媒組BALB/c幼鼠回腸末端腸黏膜較完整，且腸黏膜稍水腫，細(xì)胞間隙略增寬甚至可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，第1周改變最明顯，第2周后炎性反應(yīng)消失；回盲部可見(jiàn)淋巴濾泡反應(yīng)性增生，結(jié)腸固有層內(nèi)可見(jiàn)散在的結(jié)腸腺。LTA組BALB/c幼鼠回腸末端黏膜結(jié)構(gòu)完整性破壞，黏膜面可見(jiàn)大量細(xì)胞呈氣球樣變性甚至發(fā)生壞死，細(xì)胞間隙明顯增寬，尤以LTA處理后的第1周改變最顯著(圖1)；回盲部可見(jiàn)大量淋巴結(jié)和淋巴濾泡反應(yīng)性增生；結(jié)腸固有層反應(yīng)性增生，腸腺偶見(jiàn)變性水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。第2周后炎性反應(yīng)開(kāi)始逐漸消失。

2.2 TLR4免疫組化及圖象分析

三組各個(gè)部位腸黏膜不同時(shí)間段均表達(dá)TLR4，見(jiàn)圖2。各組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值(integral optical density,IOD)：LTA組表達(dá)量最高，與正常組和溶媒組相比差異均有顯著性(P<0.05)；各組同一組織TLR4表達(dá)隨時(shí)間延遲表達(dá)量逐漸增多以第4周最高，與第1周和第2周相比差異均有顯著性(P<0.05)；相同組織在不同組別以結(jié)腸表達(dá)最高并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，差異均有顯著性(P<0.05)；第4周LTA組結(jié)腸組織表達(dá)量最高(P<0.05，表1)。

3 討 論

自上個(gè)世紀(jì)的50年代后期Burnet提出克隆選擇學(xué)說(shuō)以來(lái)對(duì)獲得性免疫系統(tǒng)的研究取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，甚至曾一度獨(dú)占免疫學(xué)舞臺(tái)。直至90年代后期多種天然免疫識(shí)別分子的結(jié)構(gòu)、功能及分子機(jī)制被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了天然免疫的迅速崛起。Nature2001年第410卷有文獻(xiàn)報(bào)道：天然免疫這個(gè)“灰姑娘”將在21世紀(jì)登上免疫學(xué)舞臺(tái)的中心。腸道不僅是消化器官而且是最大的免疫器官,腸道細(xì)菌總數(shù)達(dá)1014，種類(lèi)超過(guò)了1 000種[6-7]。如何保持這些細(xì)菌正常地發(fā)揮功能非常重要,尤其對(duì)于嬰幼兒處于免疫系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，可以影響到嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育甚至是遠(yuǎn)期健康狀況。嬰幼兒腸道共生菌群含大量需氧菌，這些需氧菌在革蘭氏陰性細(xì)菌以大腸桿菌為代表，在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以金黃色葡萄球菌為代表，它們?cè)隗w內(nèi)代謝可以釋放其細(xì)胞壁成分LPS 、LTA等，能持續(xù)作用于腸黏膜。TLRs是先天性免疫系統(tǒng)中的一類(lèi)重要的PRRs，目前至少已報(bào)道了13種TLR[8]，在腸黏膜免疫方面普遍認(rèn)為T(mén)LR4與腸道共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及腸道共生菌的耐受密切相關(guān)。在靜息狀態(tài)下TLR4表達(dá)于細(xì)胞表面就可以更好的識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁上的抗原性成分LPS 、LTA 。TLR4在識(shí)別這些細(xì)菌的PAMP后被活化并誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[9]。哺乳動(dòng)物腸道共生菌的定植是出生后逐步建立形成的，嬰幼兒時(shí)期腸道菌群的密度及種類(lèi)在不同個(gè)體或同一個(gè)體的不同部位是有差異的，但相對(duì)于個(gè)體而言其腸道細(xì)菌在一定時(shí)期內(nèi)同一部位相對(duì)衡定[10]?？梢?jiàn)探討出生后經(jīng)胃腸道荷載LTA對(duì)腸道不同部位TLR4表達(dá)變化對(duì)深入了解腸黏膜免疫作用機(jī)制有著重要的意義。

表1BALB/c幼鼠各組腸道各段在不同時(shí)間點(diǎn)TLR4的IOD表達(dá)情況(n=5)

與LTA組同時(shí)間比較，a：P<0.05；與同一組織第4周表達(dá)比較，b：P<0.05；與LTA組第4周結(jié)腸比較，c：P<0.05；與同組結(jié)腸表達(dá)比較， d：P<0.05

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)胃腸道荷載LTA于BALB/c幼鼠，觀察腸組織各段改變?yōu)檠芯磕c黏膜免疫提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，通過(guò)免疫組化觀察TLR4表達(dá)的變化了解TLR4在腸黏膜免疫中的作用提供一定的理論依據(jù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看無(wú)論是通過(guò)NS、DMSO 還是LTA處理，TLR4在BALB/c幼鼠回腸末端、回盲部到結(jié)腸都是有表達(dá)的。從表達(dá)部位來(lái)看：回腸末端表達(dá)最低，回盲部次之而結(jié)腸表達(dá)最高；從處理因素來(lái)看：正常組表達(dá)最低，溶媒組次之，LTA組最高，說(shuō)明LTA在實(shí)驗(yàn)計(jì)量條件下可以刺激腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)但隨著腸道黏膜免疫發(fā)育成熟炎癥反應(yīng)逐漸減弱甚至消失。DMSO也具有一定的消化道毒性，可以誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答；從表達(dá)時(shí)間來(lái)看：第4周表達(dá)最高，第1周表達(dá)最低，可能與此期小鼠腸黏膜免疫系統(tǒng)已發(fā)育成熟有關(guān)。雖然DMSO具有一定的消化道毒性可以誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答，但LTA更能明顯上調(diào)TLR4的表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度明顯高于DMSO，表達(dá)水平與LTA 作用時(shí)間相關(guān)，說(shuō)明LTA能明顯增強(qiáng)TLR4表達(dá)，且其表達(dá)水平與LTA作用時(shí)間有密切相關(guān)?？傊琓LR4在BALB/c幼鼠回腸末端、回盲部到結(jié)腸都有基礎(chǔ)性的表達(dá)，經(jīng)胃腸道荷載實(shí)驗(yàn)計(jì)量條件下，DMSO、 LTA可以誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)尤以LTA明顯，且結(jié)腸部位TLR4表達(dá)明顯高于回腸末端和回盲部，提示腸道對(duì)LTA識(shí)別和反應(yīng)的部位主要發(fā)生于結(jié)腸。

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ChangesofExpressionofTLR4InducedbyLTAinIntestinalMucosaofBALB/cMicePups

ZHOU Changning，CAO Haining
(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the expression of TLR4 in intestinal mucosa of BALB/c mice pups.Method30 BALB/c mice postnatal one week were randomly divided into normal group,solvent group and LTA group,and were administrated with NS,DMSO or LTA 0.1ml one time,respectively.The pups intestine were taken out at the first,second and fourth week and the terminal ileum,cecum and colon were separated.The pathological change of the tissues were analyzed by HE staining and the expression of the TLR4 were detected by immunohistochemistry (IHC).ResultHistological examination showed that inflammatory infiltration was observed in solvent control group and LTA group.The integrity of mucosal structure was injured,the gap of the mucosa was widened and inflammatory cell infiltration or ballooning degeneration even necrosis was observed,especially in the terminal ileum of the LTA group at first week.The results of the immunohistochemistry indicated that the expression of TLR4 were detected in different tissues at different time period in three groups; the expression level of TLR4 in LTA group was the highest,compared with normal group and solvent group (P<0.05); The expression of TLR4 in the same tissues of different groups were increased over time and the level of TLR4 at the fourth week were higher when compared with which at the first or second week(P<0.05); the expression of TLR4 in colon were the highest and increased over time and the level of TLR4 in colon at the 4th week was the highest(P<0.05).ConclusionLTA can up-regulate the expression of TLR4 in the intestinal mucosa,and the site of the LTA recognition and reaction may be mainly located in the colon.

Lipoteichoic acid； intestinal mucosa； Dimethyl sulfoxide； TLR4

2095-1116(2014)05-0455-04

2014-05-30

周昌寧，博士，主治醫(yī)師，研究方向：燒燙傷所致腸源性感染，E-mail:zcn8888@sina.com.

R392

A

(此文編輯：蔣湘蓮)