柞蠶微粒子病鏡檢方法介紹

楊 旭

(丹東市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧丹東 118000)

遼寧省丹東市是全國(guó)主要柞蠶生產(chǎn)基地，全市有柞蠶制種單位40 余家，年生產(chǎn)柞蠶種繭1 500 萬(wàn)粒，種卵銷往遼寧省及省外柞蠶區(qū)，成為柞蠶種的生產(chǎn)集散地。近幾年，由于部分柞蠶制種單位只注重制種中選擇雌蛾，忽視或不采用顯微鏡對(duì)雌蛾進(jìn)行微粒子病的檢查，導(dǎo)致帶有柞蠶微粒子病的種卵投入到春、秋柞蠶生產(chǎn)中。2013年丹東市部分放養(yǎng)秋柞蠶的蠶農(nóng)因柞蠶微粒子病大發(fā)生，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2014年從全市蠶種復(fù)驗(yàn)情況看，個(gè)別蠶種單位購(gòu)進(jìn)的柞蠶母種微粒子病毒率高達(dá)2%，已嚴(yán)重影響到蠶種質(zhì)量。因此，切實(shí)嚴(yán)把柞蠶種鏡檢關(guān)，消滅柞蠶微粒子病毒，對(duì)提高柞蠶種質(zhì)量，確保蠶農(nóng)用上優(yōu)良、放心的柞蠶種，實(shí)現(xiàn)蠶業(yè)增收、蠶農(nóng)增效都具有重要意義。為此，介紹了顯微鏡使用方法及柞蠶微粒子病鏡檢技術(shù)，供柞蠶種制種單位的鏡檢人員參考。

1 顯微鏡的使用方法

1.1 顯微鏡的安裝

顯微鏡屬光學(xué)儀器，安裝時(shí)要輕拿輕放各種器件。以雙筒電光源顯微鏡為例，按照操作步驟，拿出顯微鏡的鏡座擺放穩(wěn)定后，先安裝鏡筒，然后再安裝目鏡和物鏡，物鏡鏡頭對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)中央的通光孔，先逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)，待凸凹雙方吻合時(shí)，再順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)，不要擰得過(guò)緊。插好電源，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，先采用低倍物鏡從目鏡中觀察，調(diào)節(jié)聚光器光圈(或反光鏡)，至視野合適為止。雙筒顯微鏡要調(diào)節(jié)2個(gè)目鏡之間的寬度(兩眼瞳孔間的距離)。

例(6)：I shall simply, for the present, talk little and eschew fire-proof gloves, lest I fall into certain dreadful habits irrevocably.

1.2 顯微鏡的目鏡和物鏡倍數(shù)

檢測(cè)柞蠶微孢子蟲(chóng)孢子目鏡的倍數(shù)采用15 倍或12.5 倍或16 倍，物鏡的倍數(shù)采用40 倍。

1.3 標(biāo)本樣片的顯微鏡觀察

將標(biāo)本樣片放置在載物臺(tái)上，片樣對(duì)準(zhǔn)通光孔正中，先用粗準(zhǔn)焦螺旋調(diào)整載物臺(tái)升降，物鏡下端不接觸蓋玻片，然后再用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)成像。

1.4 顯微鏡鏡頭的清理方法

2.2.4 鏡檢員 須持有柞蠶種質(zhì)量鏡檢資格證并具有熟練操作顯微鏡檢測(cè)微孢子蟲(chóng)的技術(shù)人員擔(dān)任。鏡檢員負(fù)責(zé)本鏡檢小組的管理工作，指導(dǎo)其他人員按規(guī)定程序進(jìn)行操作，對(duì)制成的合格樣片，利用顯微鏡進(jìn)行柞蠶微孢子檢驗(yàn)，負(fù)責(zé)回收檢出有柞蠶微粒子孢子的樣片及卵袋，做到統(tǒng)一管理、統(tǒng)一處理，并通知撕蛾人將合格卵袋放入墊有塑料紗的筐中待剝。對(duì)不同品種的母蛾鏡檢時(shí)，應(yīng)分清批次，以防品種混雜。

1.5 顯微鏡的保管方法

鏡檢工作結(jié)束后，要將顯微鏡擦干凈再裝箱放置于干燥處進(jìn)行妥善保管。

2 顯微鏡檢查人員的組成及分工職責(zé)

2.1 鏡檢人員組成

柞蠶微粒子孢子常見(jiàn)為長(zhǎng)橢圓形，折光性強(qiáng)，呈淡綠色，邊緣整齊，類似“大米?！睜?。

2.2 鏡檢室人員分工職責(zé)

2.2.1 拆袋人 負(fù)責(zé)取蛾卵袋編號(hào)。按序號(hào)將要鏡檢的蛾卵袋口打開(kāi)，按照先后順序?qū)⒍曷汛藕?，?yán)禁母蛾爬出蛾卵袋口，發(fā)生蛾卵袋混淆。有條件的單位，可以采用木盒豎放蛾卵袋，1個(gè)木盒可放10個(gè)蛾卵袋或自定數(shù)量，但一定要與點(diǎn)樣片數(shù)量相符。

“侵權(quán)責(zé)任”的籠統(tǒng)稱謂在很大程度上掩蓋了各種責(zé)任形態(tài)和制度之間的實(shí)質(zhì)差異。在兩大法系中，所謂的“侵權(quán)責(zé)任”都不過(guò)是各種基于相異理念的責(zé)任形態(tài)的混合物，極像一幅“馬賽克拼圖”。這幅拼圖遠(yuǎn)看是一個(gè)整體，但走近觀之，卻是由形色各異的板塊拼湊而成。

基于LDC1000的智能循跡小車的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)………………………………關(guān)志艷，張振宇，何茂榮，等(31)

2.2.2 撕蛾人 負(fù)責(zé)撕蛾。用雙手將蛾腹部背面第2～3 環(huán)節(jié)處撕開(kāi)，配合點(diǎn)片人做樣片。注意撕蛾位置要準(zhǔn)確無(wú)誤，嚴(yán)防母蛾與蛾卵袋不一致、位置顛倒。同時(shí)將鏡檢過(guò)的無(wú)病毒的卵袋放入鋪有塑料紗的蠶筐中，將鏡檢中有病毒的卵袋送交鏡檢員等。

2.2.3 點(diǎn)片人 負(fù)責(zé)點(diǎn)制樣片。點(diǎn)片人按照標(biāo)本制作要求制作樣本，蓋上蓋玻片并用手輕輕壓實(shí)后交給鏡檢員。點(diǎn)片人在制作樣片時(shí)應(yīng)注意不要挑到蛾的粘液腺、嗉囊部位，脂肪體太多或過(guò)少制成的樣片都是不合格的樣片。

顯微鏡鏡頭上如有臟物影響視野觀察時(shí)，最好用擦鏡紙橫擦，避免劃圓圈擦，有利于保護(hù)顯微鏡鏡頭。

為確保鏡檢質(zhì)量，制種單位要安排鏡檢員進(jìn)行初檢和復(fù)檢，即初檢員對(duì)檢鏡樣本懷疑時(shí)，可以由點(diǎn)片人員重新制片讓復(fù)檢員進(jìn)行復(fù)檢。復(fù)檢有微粒子孢子的，退回初檢員重檢［1］。一批母蛾鏡檢結(jié)束后，按照NY/T 1625 －2008《柞蠶種質(zhì)量》中對(duì)各級(jí)蠶種的微粒子病率的標(biāo)準(zhǔn)［2］，判定該批柞蠶種是否合格。

3 鏡檢樣本的制作

3.1 載玻片的標(biāo)準(zhǔn)

柞蠶微粒子孢子的檢查效果與樣本的制作是否合格有很大的關(guān)系。顯微鏡是光學(xué)儀器，要求精度高，載玻片最好采用長(zhǎng)7.5 cm、寬2.5 cm、厚1.5 mm的標(biāo)準(zhǔn)載玻片和20 mm ×20 mm 的蓋玻片制成樣片。為了節(jié)約成本，提高工作效率，柞蠶制種中常采用長(zhǎng)20～25 cm、寬2.5～3.0 cm、厚2～3 mm的玻璃條代替載玻片，玻璃條最好采用同一批次的玻璃切割而成，使玻璃條的厚度一致以便于鏡檢。

3.2 標(biāo)本片的制作

點(diǎn)片人用細(xì)木棍在雌蛾腹部背面第2～3 環(huán)節(jié)的節(jié)間膜處挑取少量蛾的脂肪體和體液，點(diǎn)在點(diǎn)有1%氫氧化鈉的載玻片上，如是7.5 cm 長(zhǎng)的載玻片點(diǎn)3個(gè)樣本，如是20～25 cm 長(zhǎng)的載玻片點(diǎn)10個(gè)樣本，再用細(xì)木棍在載玻片上輕輕研磨，使所點(diǎn)片樣本充分均勻，然后蓋上蓋玻片用手指壓實(shí)，防止蓋玻片與載玻片間有氣泡產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)樣本中應(yīng)能觀察到脂肪球、血淋巴等。

4 柞蠶微粒子孢子的鏡檢認(rèn)定

4.1 柞蠶微粒子孢子的形狀

柞蠶母蛾鏡檢組分為拆袋(也稱打袋)、撕蛾、點(diǎn)片、鏡檢和洗片。鏡檢人員的增減應(yīng)與制種數(shù)量和顯微鏡臺(tái)數(shù)的多少相配合，制種數(shù)量大，鏡檢人員可相應(yīng)增加，以加快鏡檢速度，一般繁制10 萬(wàn)粒種繭要配備1個(gè)鏡檢組，即鏡檢、拆袋、撕蛾、點(diǎn)片和洗片各配備1 人，超過(guò)10 萬(wàn)粒種繭可以增加鏡檢組數(shù)量。當(dāng)日需檢驗(yàn)的雌蛾，當(dāng)天必須要檢查完，并將合格的卵袋剝完，于傍晚進(jìn)入保種室保護(hù)。倒出卵的塑料紗袋或尼龍紗袋第2 天繼續(xù)裝蛾產(chǎn)卵，確保生產(chǎn)正常循環(huán)。

4.2 微粒子孢子的鏡檢

在600～640 倍的顯微鏡下，觀察視野中樣品的流動(dòng)相中含有的體液、圓形脂肪球、其它晶體等，柞蠶微粒子孢子比重大，常在流動(dòng)相的下面，或沉在脂肪球的下面。柞蠶微粒子病重的雌蛾，微粒子孢子充滿整個(gè)視野;柞蠶微粒子病輕的雌蛾，則有少量微粒子孢子在體液中游動(dòng)，也有個(gè)例就是微粒子孢子特別少，在1個(gè)視野中只能觀察到1～2個(gè)微粒子孢子，而其它視野中沒(méi)有微粒子孢子，但只要發(fā)現(xiàn)柞蠶微粒子孢子，就要堅(jiān)決淘汰“帶毒”雌蛾的蠶種，一般鏡檢時(shí)要多觀察3～4個(gè)視野，以利于柞蠶微粒子孢子的排查和認(rèn)定。

2.2.5 洗片人 負(fù)責(zé)清洗鏡檢過(guò)的沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微粒子孢子的樣片。用清水將鏡檢過(guò)的載玻片和蓋玻片清洗干凈并晾干后以備繼續(xù)使用。當(dāng)天鏡檢過(guò)的樣片要當(dāng)天清洗出來(lái)，同時(shí)負(fù)責(zé)對(duì)鏡檢室的衛(wèi)生清理工作。

編頁(yè)是歸檔工作中最基礎(chǔ)、最常見(jiàn)的工作之一，新規(guī)則對(duì)頁(yè)碼位置做出了明確要求“文件正面右上角或背面左上角的空白位置”，打破了傳統(tǒng)思維模式的“文件正面右下角、反面左下角”的頁(yè)碼編制方式，能夠?qū)ξ募许?yè)碼和編制頁(yè)碼進(jìn)行有效區(qū)分；新規(guī)則規(guī)定“擬編制頁(yè)碼與文件原有頁(yè)碼相同的，可以保持原有頁(yè)碼不變?！笨梢院?jiǎn)化流程，避免重復(fù)勞動(dòng)，但印制成冊(cè)的文件材料其頁(yè)碼位置一般為正面右下角或反面左下角，與新規(guī)頁(yè)碼的編制位置相矛盾，在一定程度上破壞了頁(yè)碼整體的統(tǒng)一性。

（3）區(qū)分核算對(duì)象。醫(yī)療服務(wù)項(xiàng)目和各種科研項(xiàng)目都是醫(yī)院成本核算的對(duì)象。其中，醫(yī)療服務(wù)項(xiàng)目通常按臨床診療類、綜合醫(yī)療服務(wù)類、中醫(yī)及其他診療類、醫(yī)技診療類等類別來(lái)區(qū)分，而科研項(xiàng)目的區(qū)分依據(jù)則應(yīng)該是項(xiàng)目的名稱。

5 “帶毒”母蛾卵、樣片的處理及注意事項(xiàng)

5.1 柞蠶微粒子病蛾卵的處理

鏡檢員鏡檢過(guò)程中要把裝有“帶毒”的卵袋進(jìn)行統(tǒng)一保管，等到當(dāng)天鏡檢全部結(jié)束后，要負(fù)責(zé)處理當(dāng)天鏡檢“帶毒”的卵。用紙袋作產(chǎn)卵袋的將紙袋與卵一同燒毀;用塑料紗袋作產(chǎn)卵袋的將“帶毒”病卵剝下后燒毀，消滅病原。

5.2 “帶毒”樣片的處理

鏡檢員在鏡檢過(guò)程中要把帶有微粒子孢子的樣片進(jìn)行統(tǒng)一保管，如果載玻片數(shù)量充足，最好將“帶毒”樣片在制種鏡檢全部結(jié)束后，統(tǒng)一用1%氫氧化鈉溶液消毒清洗;如果載玻片數(shù)量不充足，又急需載玻片時(shí)，則在當(dāng)天鏡檢結(jié)束后，將“帶毒”樣片用1%氫氧化鈉溶液消毒清洗涼干后備用。每天鏡檢結(jié)束后都要對(duì)鏡檢室進(jìn)行衛(wèi)生清掃，保持良好的鏡檢環(huán)境。

5.3 鏡檢合格柞蠶卵的處理

鏡檢人員的多少要根據(jù)制種數(shù)量的多少而增減，力爭(zhēng)當(dāng)天鏡檢任務(wù)當(dāng)天完成，尤其是在出蛾集中鏡檢數(shù)量多、鏡檢任務(wù)重的情況下，更要加強(qiáng)鏡檢工作，嚴(yán)把蠶種質(zhì)量關(guān)，在保證鏡檢質(zhì)量的同時(shí)提高鏡檢速度。當(dāng)天的鏡檢工作盡量早點(diǎn)結(jié)束，為剝種卵爭(zhēng)取時(shí)間，確保鏡檢合格的種卵當(dāng)天傍晚前進(jìn)入保種室保護(hù)。

我沈宇翀，1983年生于浙江瑞安。2005年畢業(yè)于中國(guó)美術(shù)學(xué)院國(guó)畫(huà)系山水專業(yè)，獲文學(xué)學(xué)士學(xué)位，2011年獲文學(xué)碩士學(xué)位，師從何加林?，F(xiàn)為杭州畫(huà)院專職畫(huà)師。

［1］秦利，王學(xué)英，李建男，等.中國(guó)柞蠶學(xué)［J］.北京:中國(guó)科學(xué)文化出版社，2003:169 －171.

［2］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. NY/T 1625 －2008 柞蠶種質(zhì)量［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.