精子氧化損傷機制和防護研究的新進展

孫忠凱郭凱敏綜述 田潤輝審校

1. 廣東省梅州市第一人民醫(yī)院泌尿外二科（梅州 514031）; 2

. 吉林大學第一醫(yī)院男科; 3. 吉林大學第一醫(yī)院心理衛(wèi)生科

精子氧化損傷機制和防護研究的新進展

孫忠凱1郭凱敏2綜述 田潤輝3審校

不孕不育已經是困擾夫妻生活的社會難題，其中幾乎一半是由于男方因素造成的。隨著對男性生殖的不斷研究以及精液冷凍技術的發(fā)展，人們的發(fā)現(xiàn)氧化損傷造成的精子功能和結構的改變往往對精子的質量產生影響，因此我們有必要了解氧化應激損傷的機制，尋找正確的途徑和方法來減少或預防這些損傷，其中抗氧化劑的應用被普遍關注。本文綜述精子氧化損傷的機制以及幾種常見的抗氧化劑對精子體內外的影響，旨在為臨床更好的將抗氧化劑應用于男性不育癥以及提高精子冷凍復蘇提供重要依據。

一、精子氧化損傷機制

正常情況下，男性生殖道中ROS的產生和清除之間存在一種平衡，只有在少量的活性氧（ROS）產生的情況下才會對精子正常的生理活動和功能起著重要的作用如獲能、提高精子細胞內的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平、頂體反應以及精卵融合。而往往當男性生殖系統(tǒng)出現(xiàn)病理過程，如炎癥、感染時則會導致精漿中多形核白細胞、未成熟精子ROS的大量的產生。此外，人精子在冷凍保存過程中，經歷了降溫、凍結等過程，其活力和受精率會低于新鮮精液，原因是精子在冷凍過程中受到了氧化損傷，產生過多的ROS，以至于造成精子膜、DNA和蛋白質的損傷

（一）精子膜損傷

目前眾多研究表明精子膜中含有大量的多不飽和脂肪酸，極易受到ROS的攻擊。因此ROS引起膜多不飽和脂肪酸減少，造成精子的流動性和通透性發(fā)生改變，導致精子的運動性和完整性發(fā)生不可逆的損傷。與此同時，ROS也會造成線粒體膜的損傷，使線粒體的呼吸功能發(fā)生改變，精子線粒體產生的能量減少，精子的運動能力降低[1]。

（二）DNA損傷

DNA作為遺傳物質的傳遞者，其損傷直接影響精子質量以及受精卵的產生。氧化應激會通過自由基的產生引起精子DNA發(fā)生單鏈或雙鏈的斷裂[2]，同時也由于線粒體DNA是裸露的DNA，缺少蛋白質的保護和本身修復損傷能力較弱，常常導致精子直接損傷。有理論認為精子DNA損傷主要由于有功能缺陷的精子線粒體ROS產生[3]，而且大量線粒體ROS產生與缺陷精子功能，尤其是精子活動力顯著相關[4]。也有研究認為染色質重塑不良也是精子DNA損傷的來源[5]。ROS及其代謝產物也會對細胞產生毒性，引起細胞凋亡，直接造成精子損傷[6]。

1. 廣東省梅州市第一人民醫(yī)院泌尿外二科（梅州 514031）; 2

. 吉林大學第一醫(yī)院男科; 3. 吉林大學第一醫(yī)院心理衛(wèi)生科

（三）蛋白質損傷

由于ROS可以誘導蛋白質硫醇基過氧化會使精子的功能和結構發(fā)生改變，使精子更容易受到損傷，此外大量ROS的產生還可引起頂體結構的損傷，從而降低精子的受精能力。此外，精子體外培養(yǎng)以及ART中精子的冷凍保護都會影響精子的功能和結構的變化，造成精子膜脂質過氧化、DNA和線粒體損傷等一系列變化。

二、抗氧化劑的應用

（一）維生素C

維生素C也稱抗壞血酸，是可生育男性精液中主要的抗氧化劑，其在精液中的濃度是血漿中的10倍[7]，同時在全部斷鏈抗氧化劑中，它的抗氧化能力占到了65%。有研究顯示，正常生育男性精液中維生素C含量為（448.71±93.18）μmol/L，不育男性則為（412.81±114.51）μmol/L，兩組比較有統(tǒng)計學差異[8]。同時發(fā)現(xiàn)兩組含量與正常形態(tài)精子數(shù)顯著相關。Akmal等對13例年齡在25～35歲的不育男性給予維生素C 1g，1d兩次，連用2個月，發(fā)現(xiàn)患者精子濃度、精子活力、正常形態(tài)精子數(shù)顯著增加，認為維生素C可以作為一種改善精子質量的藥物[9]。Fanaei等[10]最近研究發(fā)現(xiàn)畸形精子癥精液中添加維生素C保護氧化應激損傷，能夠提高輔助生殖成功率。

（二）維生素E

維生素 E又名生育酚, 是精子抗氧化系統(tǒng)中最重要的組成成分，也是對抗ROS和脂質過氧化發(fā)生的一種主要的保護精子膜的抗氧化劑[11]。一項研究報道，對690例特發(fā)性少弱精子癥的不育男性給予每日200μg硒元素聯(lián)合400單位維生素E連服100d，發(fā)現(xiàn)52.6%的患者精子活力和形態(tài)明顯改善，10.8%的患者自然懷孕，認為聯(lián)用硒和維生素E可以改善精子質量[12]。Tunc等[13]對50例不育男性患者給予復合營養(yǎng)片Menevit（包括番茄紅素、維生素C、E，硒、葉酸）治療3個月，發(fā)現(xiàn)患者精子DNA完整性和魚精蛋白含量顯著改善，同時伴隨精漿ROS生成減少和凋亡下降，而對精子活力、濃度及形態(tài)未見明顯改善。

在冷凍精液方面，Taylor等[14]研究發(fā)現(xiàn)冷凍保護劑中添加200μmol的維生素E可以顯著改善冷凍復蘇后精子活力，但對精子存活率及DNA碎片無影響，此外還發(fā)現(xiàn)這種保護作用對年齡超過40歲的男性較明顯。而Kalthur等[15]發(fā)現(xiàn)冷凍保護劑中添加5 mM維生素可以顯著改善正常精子及弱精子癥患者冷凍復蘇后精子活力以及DNA完整性。

（三）肉堿

肉堿（carnitine）又名肉毒堿或卡尼汀，幾乎存在人體所有細胞，其存在L-肉堿和D-肉堿兩種分子形式，前者在人體內具有生物活性，肉堿大多數(shù)都能在生物體內合成，在雄性動物和男性生殖道中，肉堿主要集中于附睪中，由于附睪本身不具有合成肉堿的功能, 所以主要通過肉堿轉運蛋白從血漿中攝取。L-肉堿作為轉運脂肪酸進入線粒體的重要載體，對精子運動的啟動、精子成熟的促進和精子受精能力的提高,最近研究顯示carnitine主要通過增加LDH-C4活性，從而影響受孕率[16]。以及在精子活動中所需的能量代謝和降低精漿中ROS含量、降低氧化應激反應、保護精子膜的穩(wěn)定性、抗精子凋亡等活動起到了重要的作用。肉堿還參與精子膜表面糖復合物的生成，進而影響男性生育能力[17]。Lenzi等[18]發(fā)現(xiàn)100位少弱畸形精子癥患者每天服用肉堿2 g治療6個月后，精子濃度和移動力顯著提高，第2年發(fā)現(xiàn)56位不育男性患者服用左旋肉堿（2g/d）和乙酰肉堿（1g/d）6個月后其精子數(shù)目和活力也提高。同時，一項關于219位患有精索靜脈曲張患者采取上述同樣的方法治療4個月后發(fā)現(xiàn)精子濃度、移動和形態(tài)也明顯改善[19]。Balercia等[20]也對60位弱精子癥患者采取不同劑量的左旋肉堿和乙酰肉堿聯(lián)合應用發(fā)現(xiàn)精子移動速度也明顯提高。

（四）己酮可可堿

己酮可可堿（pentoxifylline, PF）是非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，屬于黃嘌呤衍生物的一種。己酮可可堿與其他黃嘌呤衍生物相比，具有較高的水溶性，作用時間更長，作用效果更好，它能夠阻斷環(huán)腺苷酸（cAMP）轉變?yōu)橄佘账幔ˋMP），使胞內cAMP升高，而cAMP在精子代謝中起到關鍵的作用，作為第二信使通過激活PKA（cAMP依賴性蛋白激酶），使靶細胞蛋白磷酸化，從而涉及到多種精子功能的調控所帶來的效應，如促進頂體反應[21]，改善精子的穿卵活動以及保護精子質膜等作用。一項隨機對照安慰劑雙盲實驗研究顯示，PF400mg 一日兩次，服用24周，在精子濃度，精子活力、正常形態(tài)精子數(shù)顯著高于基線水平，SOD樣活性和過氧化氫酶活性也顯著高于安慰劑組[22]。Amer等[23]研究發(fā)現(xiàn)添加己酮可可堿制備的精液，其精子穿卵率、受精卵子數(shù)、胚胎總數(shù)、優(yōu)質胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)均明顯高于未添加組，妻子受孕率也高于未添加組。

（五）超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是生物體內抗氧化防御體系的重要酶類，是精漿中主要的抗氧化物酶類，其活性與精液質量直接相關[24]。SOD活性降低或含量減少則抗氧化功能受到抑制，從而導致體內大量自由基的蓄積，引起脂質過氧化，超氧離子介導的組織損傷等一系列反應，產生細胞毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，精液中SOD活性下降是導致男性不育的原因之一。在精子懸浮液中加入外源性的SOD能夠保護精子線粒體和質膜，以及對抗精液中白細胞產生的ROS的損害以及保護精子的移動力和尾部擺動頻率[25]。同時，在精子冷凍保存中發(fā)現(xiàn)，精子凍后SOD含量與凍后精子移動力的恢復呈正相關[26]，這間接的反應SOD含量與機體抗氧化能力的強弱有關。

（六）過氧化氫酶

過氧化氫酶（catalase，CAT）是過氧化物酶體的標志酶, 約占過氧化物酶體酶總量的40%，存在于所有需氧細胞中，能夠催化過氧化氫轉變?yōu)檠醴肿雍退?，是生物防御體系的關鍵酶之一，在男性不育中與超氧化物歧化酶具有同等的地位。研究中發(fā)現(xiàn)人的精子和精漿中都有過氧化氫酶,但精漿中的過氧化氫酶活力要顯著高于精子。與此同時，研究人員在上述實驗中又進行了更深入的研究，他們對評估精子參數(shù)的指標更為細化，其測定指標包括了精子的活率、活力，線粒體膜蛋白，細胞凋亡及DNA損傷、ROS的產生。結果顯示，添加CAT可以提高精液質量、減少ROS的生成并降低了DNA損傷[27]。此外，Moubasher等[28]發(fā)現(xiàn)在新鮮或處理后的精液中添加CAT進行冷凍復蘇，能夠提高精子的前向運動力、活力和DNA完整性，這可能是由于CAT的添加抑制ROS的產生從而降低冷凍過程中所引起的氧化應激損傷。

（七）還原型谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是一種由3個氨基酸組成的小分子肽，它作為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑。Varghese等[29]研究發(fā)現(xiàn)甘油冷凍保護劑中加入5 mM GSH，可以增加人冷凍保存精子DNA完整性，但并不能減少脂質過氧化或提高精子活力。 而Gadea等[30]發(fā)現(xiàn)冷凍復蘇后精液GSH可以減少64%，添加1mM或 5 mM GSH可以提高精子活力及前向運動精子數(shù)，對精子存活率無改善。

（八）植物天然抗氧化劑

白藜蘆醇（resveratrol, RES）是一種生物性很強的天然多酚類物質，一種天然的抗氧化劑。 RES主要通過清除或抑制氧自由基的產生和脂質過氧化，調節(jié)抗氧化相關酶活性等機制發(fā)揮抗氧化作用。Garcez[31]研究發(fā)現(xiàn)RES可以減少精子冷凍引起的氧化損傷，但對凍融引起的精子活力和形態(tài)損傷沒有明顯的抑制效果。

槲皮素（quercitrin, QU）具有多種生物學活性的黃酮類化合物。它存在于許多植物的花、葉、果實中，多以甙的形式存在。Ben Abdallah等[32]研究表明槲皮素可以改善精子抗氧化酶的活性，保護精子免受過氧化氫對精子活力和脂質過氧化的損害。Zribi等[33]研究發(fā)現(xiàn)精子冷凍保護劑中加入槲皮素可以顯著改善凍后精子活力、活率、DNA完整性。

展 望

面對當前男性不育所帶來的問題，ROS的過量產生導致精子氧化應激損傷已成為人們關注的重點，研究氧化損傷的來源與機制是解決該問題的關鍵。而在尋求解決該問題的過程中發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑的使用在防止ROS產生、降低氧化應激損傷以及提高精子質量中發(fā)揮著至關重要的作用。如何選擇抗氧化劑的種類與濃度、冷凍保護液與精液的比例，并將這些抗氧化劑應用于臨床，還有待進一步研究。

不育, 男性; 精子; 氧化性應激

1 Walczak-Jedrzejowska R, Wolski JK, Slowikowska-Hilczer J.Cent European J Urol2013; 66(1): 60-67

2 Aitken RJ, De Iuliis GN, Finnie JM,et al. Hum Reprod2010; 25(10): 2415-2426

3 Koppers AJ, Garg ML, Aitken RJ.Free Radic Biol Med2010; 48(1): 112-119

4 Koppers AJ, De Iuliis GN, Finnie JM,et al. J Clin Endocrinol Metab2008; 93(8): 3199-3207

5 De Iuliis GN, Thomson LK, Mitchell LA,et al. Biol Reprod2009; 81(3): 517-524

6 Chatterjee S, Gagnon C.Mol Reprod Dev2001; 59(4): 451-458

7 Lewis SE, Sterling ES, Young IS,et al. Fertil Steril1997; 67(1): 142-147

8 Colagar AH, Marzony ET.J Clin Biochem Nutr2009; 45(2): 144-149

9 Akmal M, Qadri JQ, Al-Waili NS,et al. J Med Food2006; 9(3): 440-442

10 Fanaei H, Khayat S, Halvaei I,et al. Iran J Reprod Med2014; 12(2): 103-110

11 Bolle P, Evandri MG, Saso L.Contraception2002; 65(4): 313-315

12 Mohammad KM, Samaneh T.Int J Gen Med2011; 4: 99-104

13 Tunc O, Thompson J, Tremellen K.Reprod Biomed Online2009; 18(6): 761-768

14 Taylor K, Roberts P, Sanders K,et al. Reprod Biomed Online2009;18(2): 184-189

15 Kalthur G, Raj S, Thiyagarajan A,et al. Fertil Steril2011; 95(3): 1149-1151

16 Aliabadi E, Karimi F, Rasti M,et al. J Reprod Infertil2013; 14(2): 56-61

17 Aliabadi E, Karimi F, Talaei-Khozani T.Iran J Med Sci2013; 38(2): 107-115

18 Lenzi A, Lombardo F, Sgrò P, et al.Fertil Steril2003; 79(2): 292-300

19 Cavallini G, Ferraretti AP, Gianaroli L,et al. J Androl2004; 25(5): 761-70; discussion 771-772

20 Balercia G, Regoli F, Armeni T,et al. Fertil Steril2005; 84(3): 662-671

21 Mirshokraei P, Hassanpour H, Mehdizadeh A,et al. Res Vet Sci2011; 91(2): 281-284

22 Safarinejad MR.Int Urol Nephrol2011; 43(2): 315-328

23 Amer M, Metawae B, Hosny H,et al. Iran J Reprod Med2013; 11(11): 939-944

24 Kawakami E, Takemura A, Sakuma M,et al. J Vet Med Sci2007; 69(2): 133-136

25 Forouzanfar M, Abid A, Hosseini SM,et al. Cryobiology2013; 67(3): 394-397

26 Buffone MG, Calamera JC, Brugo-Olmedo S,et al. Fertil Steril2012; 97(2): 293-298

27 Cavallini G.Asian J Androl2006; 8(2): 143-57

28 Moubasher AE, El Din AM, Ali ME,et al. Andrologia2013; 45(2): 135-139

29 Varghese AC, Das S, Bhattacharya AK,et al. Fertil Steril2005; 84: S410–S411

30 Gadea J, Molla M, Selles E,et al. Cryobiology2011; 62(1): 40-46

31 Garcez ME, dos Santos Branco C, Lara LV,et al. Fertil Steril2010; 94(6): 2118-21

32 Ben Abdallah F, Zribi N, Ammar-Keskes L.Andrologia2011; 43(4): 261-265

33 Zribi N, Chakroun NF, Ben Abdallah F,et al. Cryobiology2012; 65(3): 326-331

（2014-06-26收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.019

R 698.2