原代大鼠胰島的分離純化及功能鑒定1）

李小東，郭 慶，高璟英，張 婉，武冬梅，劉云峰，章 毅

老年人是糖尿病高發(fā)人群，在全部心腦血管病死亡的病例中，除直接與糖尿病有關(guān)外，其余13%的病例與高血糖有關(guān)，高血壓合并糖尿病成為腦卒中死亡的重要原因［1］。近年來有關(guān)糖尿病治療研究引起了人們的關(guān)注，其中有很多胰島移植的研究。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，雖然各個方面取得了很大進步，但其移植效果并不理想，在人體的胰島移植中，活性能保持一年以上不超過40%［2］。其主要原因是胰島分離純化后活性不高，移植后的排斥反應(yīng)以及免疫抑制劑對大鼠胰島的毒性作用［3］。因此獲得足量、活性良好的胰島非常重要。本實驗采用膠原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分離液直接離心分得大鼠胰島，并對其活性及功能進行評價。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD 大鼠，體重250g～300g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 膠原酶P 購自瑞士羅氏公司；雙硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚賴氨酸（分子量15～30萬）購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；DispaseⅡ購自美國Amresco公司；青鏈霉素（雙抗）購自北京索萊寶公司；AO－PI購自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰島素放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（北京世安科技林凈化技術(shù)有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（北京博奧恒信生物科技有限公司）；臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡IX81（日本奧林巴斯IX51）。

1.4 方法

1.4.1 原代大鼠胰島及胰島細胞分離培養(yǎng) 無菌條件下，大鼠斷頭處死，迅速打開胸腹，在膽總管匯入十二指腸的入口處用止血鉗夾住，經(jīng)膽總管緩慢注入13mL 4 ℃的1mg／mL膠原酶P溶液，38 ℃水浴消化11min，取出立即加入20 mL 4℃培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）終止消化，劇烈振搖胰腺至細沙狀，用孔徑350μm 的濾網(wǎng)過濾，1 200r／min，離心2 min，去上清，加入10 mL 分離液Histopaque 1077至管中重懸組織，將10mL 1640培養(yǎng)基慢慢順管壁注入管中，3 200r／min，離心23min。收集界面間的懸浮胰島，在含10%胎牛血清，100U／mL 青霉素，100μg／mL鏈霉素的1 640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃，5%CO2，100%濕度的孵箱中培養(yǎng)［4］。將胰島用含3 mmol／L EDTA 的無鈣鎂PBS溶液脫鈣后，加入DispaseⅡ（5mg／mL）酶液，培養(yǎng)箱孵育6min，用4℃培養(yǎng)液終止消化，吹打使胰島分散，1 000 r／min，離心2min，將胰島細胞接種在培養(yǎng)皿中，按胰島培養(yǎng)條件培養(yǎng)［4］。

1.4.2 大鼠胰島的DTZ 純度鑒定 DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液（pH7.8）1∶1 000稀釋，0.22μm 孔徑濾膜過濾，與胰島制備物混合，室溫10 min后鏡檢［5］；大鼠胰島的AO／PI活性鑒定：用Hanks液配制儲存液，AO：670μmol／L，PI：750μmol／L，4 ℃避光保存，使用前取0.01mL AO 與1mL PI混合，用Hanks液10倍稀釋，0.22μm 孔徑濾膜過濾，與胰島混合10min，在熒光顯微鏡下采用490nm 激發(fā)光，510nm 發(fā)射光鏡檢［6］。

1.4.3 胰島素分泌實驗 配置葡萄糖濃度分別是2.8mM，8.3mM，16.7mM 的KRBH 孵育液。方法：①取6個Eppendorf管標號，各加1mL 2.8mM 葡萄糖的KRBH 液，每管挑入5個胰島，37℃孵育30 min 后，棄上清。②每管再加入1 mL 2.8 mM 葡萄糖的KRBH 液孵育，37℃孵育30 min，收集上清，標號，－20℃保存待測。③依次給予8.3mM 葡萄糖、16.7mM 葡萄糖孵育，方法同上，收集上清，－20℃保存待測。用放射免疫法檢測上述待測樣品。

1.4.4 激光共聚焦檢測細胞內(nèi)部鈣離子濃度 胰島用Fluo 4－AM（4μM）染料在37℃的條件下孵育半小時，孵育完用含2.8 mM 糖的Hanks液輕輕沖洗兩遍，防止染液殘留影響之后的細胞內(nèi)鈣離子濃度的測定，再加入2mL 含2.8mM 糖Hanks液。使用奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡IX81觀察，設(shè)置激光波長494 nm，發(fā)射波長516nm。所得到的比值F／F0（細胞熒光減去背景熒光和自身熒光）反應(yīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化［4］。

2 結(jié) 果

2.1 原代大鼠胰島 一般只離體培養(yǎng)7d，在體視顯微鏡下觀察，胰島質(zhì)地飽滿，呈橢圓形或圓形，透光率較小，直徑在100～300μm；胰島細胞在倒置顯微鏡下觀察呈球形，部分細胞之間相連成細胞團。胰島中包含α，β，δ和pp細胞，但是在體積上有明顯差別，β細胞是α細胞的2～3倍，δ細胞比α細胞更小，β細胞直徑11～13.5μm。

2.2 DTZ 和AO／PI對胰島純度及活性鑒定 分別在40 倍，100倍的顯微鏡下觀察，可見全部胰島被DTZ 染成猩紅色；在490nm 激發(fā)光，510nm 發(fā)射光的熒光顯微鏡下觀察，培養(yǎng)過夜的胰島97%以上可被AO／PI染成綠色。

2.3 胰島素分泌實驗 胰島分別在葡萄糖濃度為2.8mM（2.8G），8.3mM（8.3G），16.7mM（16.7G）的KRBH 溶液中孵育半小時后，所測胰島素值分別為：（11.7±1.4）uIU／mL，（38.2±8.7）uIU／mL，（86.3±5.1）uIU／mL，胰島素分泌量隨葡萄糖濃度增加而增加。

2.4 激光共聚焦技術(shù)檢測胰島細胞中鈣離子濃度 實驗中，在2.8mM 葡萄糖（n＝10）的基礎(chǔ)上，8.3mM 葡萄糖（n＝10）可以明顯升高胰島細胞內(nèi)的鈣離子濃度；16.7 mM 葡萄糖（n＝10）在8.3mM 的葡萄糖的基礎(chǔ)上進一步的升高了胰島細胞中的鈣離 子 濃 度。2.8Gvs8.3G（P＜0.0 5）；2.8Gvs1 6.7G（P＜0.001）；8.3Gvs 16.7G（P＜0.01）。

3 討 論

胰島細胞移植為治療胰島素依賴性糖尿病開辟了一條新的途徑［7］。胰島移植不僅可糾正糖代謝紊亂，還能避免因血管病變引起的眼、腎、腦和心血管并發(fā)癥，但胰島的分離純化是一個較復雜的過程，所獲胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量受很多因素影響，稍有偏差即會直接影響治療效果，因此備受關(guān)注［8］。如何獲得高純度及高活性的胰島仍是亟待解決的問題。

目前成年大鼠胰島分離純化多采用機械研磨與Ficoll密度梯度離心法［9］，而本實驗采用單一的Histopaque－1077是即用型的，減少了Ficoll不同密度分離劑的配制及除菌的步驟。由于純化時只有Histopaque－1077和1640培養(yǎng)基兩個密度，純化梯度易于形成，使得胰島的純化變得簡便，縮短了分離大鼠胰島的時間。此法減少了多步分離過程中不確定的因素對胰島質(zhì)量的影響，盡可能快的給予離體胰島營養(yǎng)，利于獲得純度高，活性良好的胰島。Histopaque－1077 較Ficoll等能提供一個更好的滲透環(huán)境，能更好地保持胰島的活性與功能。實驗證實，膠原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分離得到的大鼠胰島純度高、活性、功能良好。同時我們總結(jié)了大鼠胰島分離純化過程中一些體會：①胰腺灌注的成功與否是分離純化胰島的關(guān)鍵，文獻報道多采用4.5號頭皮針穿刺灌注，為防止針尖過于銳利，刺破膽管壁致膠原酶外溢，我們采用與此針頭同樣粗細的細塑料管（尖端較鈍）進行灌注。②灌注時用線結(jié)扎位置要在最低一支膽管與主干的匯合支以下，以防止部分酶液倒流至肝內(nèi)。③應(yīng)采用4℃的膠原酶灌注，因溫度高時膠原酶過早消化胰管和腺泡，灌注好的胰腺應(yīng)置于0℃的冰袋上剔除非胰腺組織，這些非胰腺組織無法消化且會黏附正常胰腺組織，不利于過濾。④胰腺消化分散后，應(yīng)立即加入20mL 4℃培養(yǎng)液，混勻終止消化。如果培養(yǎng)液用量太少，則不能終止膠原酶的作用，造成過度消化，破壞胰島完整性，影響分離效果［10］。

DTZ是一種螯合鋅、銅、鉛等的指示劑，因為大鼠的胰島β細胞含鋅，DTZ染液可將胰島染成猩紅色，所以DTZ對胰島是特異性染色［5］；AO 為浸潤性染料（膜通透性），可侵入活細胞與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)出綠色熒光；PI為排斥性染料（膜不通透性），不能進入活細胞，與死亡（膜通透性改變）細胞的核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光［6］。實驗中，所有胰島可被染成猩紅色，表明用此種實驗方法分得的胰島純度較高；AO／PI可將97%以上胰島染成綠色，表明胰島活性良好。葡萄糖依賴性的胰島素分泌實驗證實了胰島功能良好。胰島細胞中鈣離子濃度會升高會促進胰島素分泌。我們對胰島細胞中鈣離子濃度進行檢測后發(fā)現(xiàn)，利用高濃度葡萄糖刺激胰島時，可明顯升高胰島中鈣離子濃度。利用膠原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分離液離心純化胰島是一種較簡單可靠的方法。

［1］ Zhao YQ，Lian YY，Li GF，et al.Influential factors for short－term prognosis of patients with acute cerebral infarction：A logistic regression analysis［J］.Medical，2011，36（3）：265－268.

［2］ Bretzel RG，Hering BJ，Schultz AO，et al.International islet transplant registry report［M］.1996－1997.Springer，1996，153－60.

［3］ 楊永生，孫寶震，解英俊，等.大鼠胰島分離純化方法的改進［J］.中國實驗診斷學，2006，10（12）：1486－1488.

［4］ Zhang Y，Liu Y，Qu J，et al.Functional characterization of hyperpolarization－activated cyclic nucleotide－gated channels in rat pancreaticβcells［J］.，2009，203（1）：45－53.

［5］ Latif Z，Noel J，Alejandro R.A simple method of staining fresh and cultured islets［J］.Transplantation，1988，45（4）：827.

［6］ Lee DY，Yang K，Lee S，et al.Optimization of monomethoxy‐polyethylene glycol grafting on the pancreatic islet capsules［J］.2002，62（3）：372－377.

［7］ 張鑫，高居忠，王學明，等.成年大鼠胰島分離純化的實驗研究［J］.首都醫(yī)科大學學報，2003，24（3）：314－316.

［8］ Oneil JJ，Stegemann JP，Nicholson DT，et al.The isolation and function of porcine islets from market weight pigs［J］.Cell Transplantation，2001，10（3）：235－246.

［9］ Brandhorst D，Brandhorst H，Hering BJ，et al.Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans：10years of experience［J］.Experimental Clinical Endocrinology ＆Diabetes，2009，103（S 02）：3－14.

［10］ 李永翔，李戈，董維平，等.大鼠胰島分離純化技術(shù)的改進［J］.復旦學報：醫(yī)學版，2006，33（2）：266－8.