青蒿琥酯誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展

蔣紅艷,姚安貴,江尚飛

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校 藥學院,重慶 400030)

青蒿琥酯誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展

蔣紅艷,姚安貴△,江尚飛

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校 藥學院,重慶 400030)

近年來的研究表明，青蒿琥酯具有抗腫瘤活性，能夠明顯抑制胃癌、食管癌、結腸癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，作用機制包括啟動內源性線粒體凋亡途徑，增高Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表達，降低Bcl-2蛋白表達等。本文對青蒿琥酯誘導腫瘤細胞凋亡的作用及其機制進行綜述。

青蒿琥酯；腫瘤細胞；凋亡

青蒿琥酯(artesunate,Art)屬于青蒿素衍生物,由于青蒿素及其衍生物起效快、毒性低、療效確切,已成為臨床上治療瘧疾的一線藥物［1-2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯還有抗腫瘤活性,具有成為一種新的高效低毒抗腫瘤藥物的潛力,其對多種腫瘤,如胃癌、食管癌、結腸癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤等起抑制作用,本文對其抗腫瘤作用機制進行大量研究,以期進一步明確其作用靶點,為青蒿琥酯的臨床應用奠定基礎［3］。

1 誘導腫瘤細胞凋亡

1.1 誘導人胃癌細胞凋亡 吳方紅等［4］體外培養(yǎng)人胃癌細胞HGC27細胞,青蒿琥酯組加入青蒿琥酯終濃度為10、20、40、80、100mg/L的培養(yǎng)液,對照組加入等量的培養(yǎng)液,并設立調零孔,四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定其對HGC27細胞增殖的影響;倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化;青蒿琥酯(濃度分別為20、40、80mg/L)處理HGC27細胞48 h后,分別采用流式細胞儀檢測細胞凋亡、分光光度計檢測casepase-3、caspase-9相對活性、Western blot法檢RUNX-3蛋白表達情況。實驗結果顯示,濃度為10～100mg/L的青蒿琥酯能呈劑量和時間依賴性地抑制HGC27細胞的增殖;倒置顯微鏡下可觀察到典型的細胞凋亡形態(tài)。濃度分別為20、40、80 mg/L的青蒿琥酯作用于HGC27細胞48h后,細胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%,而對照組凋亡率僅為2.2%。青蒿琥酯誘導細胞凋亡的作用機制可能與其增加細胞 casepase-3、caspase-9活性以及上調RUNX-3蛋白的表達有關。此外,青蒿琥酯也能抑制人胃癌細胞SGC-7901的增殖并誘導其凋亡,其中caspase-3蛋白的高表達在促進SGC-7901細胞凋亡中起著重要作用［5］。

1.2 誘導人食管癌細胞凋亡 劉亮等［6］以濃度分別為30、60、120μmol/L的青蒿琥酯作用于食管鱗癌Ec9706細胞12 h,對照組采用生理鹽水替代青蒿琥酯。于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,采用流式細胞術AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡水平,熒光染料羅丹明123染色檢測細胞線粒體膜電位水平。采用流式細胞術檢測caspase-3蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯作用于Ec9706細胞后,Ec9706細胞形態(tài)發(fā)生變化,細胞變圓,體積變小,并漂浮于細胞培養(yǎng)液中。不同濃度的青蒿琥酯作用于Ec9706細胞12 h后,藥物呈劑量依賴性地促進Ec9706細胞的凋亡,與對照組相比具有極顯著性差異(P＜0.01);藥物呈劑量依賴性地降低Ec9706細胞線粒體膜電位,與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。與對照組相比,青蒿琥酯組Ec9706細胞中caspase-3蛋白表達水平顯著增加(P＜0.01),且呈藥物劑量依賴性。因此,降低細胞線粒體膜電位,啟動內源性線粒體凋亡途徑,激活caspase-3蛋白等可能是青蒿琥酯誘導Ec9706細胞凋亡的機制。

1.3 誘導人結腸癌細胞凋亡 黃偉煒等［7］采用濃度分別為10,20,30μmol/L青蒿琥酯處理人結腸癌細胞HCT-8細胞后,細胞凋亡率分別為(17.1±3.8)%,(29.5±5.1)%,(41.4±5.8)%,顯著高于空白對照組的(5.1±1.4)%(P＜0.05);采用濃度為20μmol/L青蒿琥酯處理人結腸癌細胞HCT-8細胞后,細胞G0/G1期所占比例隨著藥物作用時間延長而增加,S期與G2/M期細胞所占比例則下降;采用濃度分別為10,20,30μmol/L青蒿琥酯處理組Bax蛋白表達水平分別為(0.20±0.03),(0.40±0.05)和(0.50±0.08),顯著高于空白對照組的(0.06±0.02)(P＜0.05);Bcl-2蛋白表達水平未見明顯變化,Bcl-2/Bax呈下降趨勢。因此,青蒿琥酯誘導凋亡人結腸癌細胞HCT-8細胞的作用機制可能與其阻滯結腸癌細胞周期、上調促癌基因Bax表達有關。

1.4 誘導人胃腺癌細胞凋亡 朱奔奔等［8］研究了青蒿琥酯對人胃腺癌MKN45細胞株增殖抑制和誘導凋亡作用,將不同濃度的青蒿琥酯作用于體外培養(yǎng)的人胃腺癌MKN45細胞株,空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基,采用MTT檢測細胞生長抑制率;采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況;應用Western Blot法檢測不同濃度的青蒿琥酯處理MKN45細胞株后凋亡相關蛋白Bax、caspase-9及caspase-3等表達情況。MTT實驗結果顯示,青蒿琥酯對MKN45細胞增殖有顯著的抑制作用,且對細胞增殖抑制作用與藥物作用時間和濃度呈正相關(P＜0.05)。并隨著青蒿琥酯濃度的增加,MKN45細胞凋亡率逐漸升高(P＜0.05)。ART使MKN45細胞 Bcl-2蛋白表達明顯降低,Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表達明顯增高,且對凋亡相關蛋白表達的調控作用與藥物濃度呈正相關。

1.5 誘導人肝癌細胞凋亡 雷佳紅等［9］采用青蒿琥酯(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)處理人肝癌 HepG2 細胞 48 h,藥物呈濃度依賴性地促進HepG2細胞的凋亡,且當青蒿琥酯濃度在6.25μg/mL以上時,各組凋亡率與對照組比較有極顯著性差異(P＜0.01),細胞發(fā)生凋亡形態(tài)學改變。各組caspase-3的表達與對照組比較極顯著性差異(P＜0.01)。因此認為青蒿琥酯能夠顯著誘導HepG2細胞凋亡,其機制可能與增強凋亡相關基因caspase-3的表達有關。

1.6 誘導人白血病細胞凋亡 黃利華［10］提取11例急性白血病患者骨髓液進行原代細胞培養(yǎng),以對數(shù)生長期細胞為干預點,實驗組將不同濃度青蒿琥酯作用于細胞,對照組加入等體積的培養(yǎng)液,分別采用MTT法檢測青蒿琥酯對人AL原代細胞增殖的影響;透射電子顯微鏡觀察青蒿琥酯作用后細胞的形態(tài)變化;免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白。其研究結果顯示,與對照組比較,各劑量組青蒿琥酯作用于人白血病原代細胞48 h后細胞形態(tài)呈現(xiàn)2種不同的形式:脹亡,細胞體積明顯增大,細胞漿呈空泡樣改變,細胞膜部分完整,線粒體腫脹,細胞核多被擠向細胞一側;凋亡,細胞體積縮小,染色質固縮,或裂解形成1個或數(shù)個大小不一的致密凋亡小體。青蒿琥酯處理細胞48 h,可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2含量,促進凋亡蛋白Bax、C-myc的釋放。推測其抗白血病作用的分子機制可能是線粒體途徑,但其最佳作用靶點有待研究。

1.7 誘導人子宮內膜癌細胞凋亡 王利娟等［11］探討了青蒿琥酯抑制人子宮內膜癌HEC-1B細胞增殖及誘導其凋亡的機制,MTT實驗顯示青蒿琥酯能夠呈劑量-時間依賴性地抑制HEC-1B細胞生長;流式細胞儀檢測顯示青蒿琥酯能夠使G0/G1期細胞比例上升(P＜0.05),G2/M期細胞比例下降(P＜0.05);檢測凋亡率實驗結果顯示,實驗組與對照組相比,5mg/L青蒿琥酯組凋亡率無統(tǒng)計學差異,20、80 mg/L青蒿琥酯組凋亡率均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);RT-PCR結果顯示,青蒿琥酯組Livin mRNA表達下調,caspase-3 mRNA表達上調。因此,青蒿琥酯抑制人子宮內膜癌細胞HEC-1B的增殖,誘導其凋亡,其作用機制可能是通過抑制Livin mRNA表達、進而增加caspase-3 mRNA表達,誘導子宮內膜癌HEC-1B細胞發(fā)生細胞周期阻滯有關。

1.8 誘導骨髓瘤細胞凋亡 王素云等［12］研究表明,濃度為25～50μg/mL的青蒿琥酯對骨髓瘤RPMI8226細胞的抑制率為33.55%～74.71%。濃度為50μg/mL青蒿琥酯誘導RPMI8226細胞最大凋亡率達(68.1±5.9)%。采用不同濃度青蒿琥酯處理骨髓瘤RPMI8226細胞48 h后,Survivin mRNA及蛋白表達水平明顯降低,caspase-3、caspase-7 mRNA及蛋白活性明顯升高(P＜0.01)。因此,青蒿琥酯增強caspase-3、caspase-7活性,抑制抗凋亡分子survivin表達可能是其抑制骨髓瘤RPMI8226細胞、誘導骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡的機制。

1.9 誘導黑素瘤細胞凋亡 肖敏等［13］觀察了青蒿琥酯對人皮膚惡性黑素瘤A875細胞增殖和凋亡的影響,并探討相關機制。MTT實驗結果顯示不同濃度的青蒿琥酯能有效抑制A875細胞的增殖,并呈濃度依賴性;Annexin V/PI雙染法流式細胞術結果顯示,青蒿琥酯能夠誘導A875細胞凋亡,并呈濃度依賴性。Western blot結果顯示不同濃度青蒿琥酯作用A875細胞后,caspase-3、caspase-8及caspase-9的蛋白表達水平均出現(xiàn)增高,并呈劑量依賴性,提示青蒿琥酯誘導A875細胞凋亡與上調caspase-8、caspase-9以及caspase-3有關。

1.10 誘導T細胞淋巴瘤細胞株凋亡 陳均法等［14］采用MTT比色法檢測青蒿琥酯對T細胞淋巴瘤細胞株Jurkat細胞體外生長的抑制作用;采用細胞形態(tài)學、DNA瓊脂糖凝膠電泳、DNA的PI染色等觀察和檢測Jurkat細胞的凋亡;采用Western blot法檢測Jurkat細胞凋亡過程中Bc-2、Bax、caspase-8和ICAD蛋白表達水平的變化。結果顯示,以濃度為2～64μg/mL青蒿琥酯作用T細胞淋巴瘤細胞株Jurkat細胞,能夠抑制細胞增殖,促進Jurkat細胞凋亡;隨著藥物濃度的增加,Bcl-2和ICAD蛋白表達逐漸下降,而Bax蛋白表達上調,caspase-8蛋白出現(xiàn)明顯的剪切激活帶;提示青蒿琥酯既可通過線粒體途徑又可通過外源性途徑誘導T細胞淋巴瘤細胞株Jurkat細胞凋亡,但還需進一步研究具體的信號轉導機制。

2 作用機制

腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡的調節(jié)紊亂具有非常密切的關系,細胞凋亡對腫瘤的發(fā)生起負調控作用?；蛩缴洗偌毎蛲龌蛉鏿53等的失活,以及抗細胞凋亡基因如Bcl-2,Survivin等的過度表達,是腫瘤發(fā)生的重要原因。在正常組織中Bcl-2幾乎不表達,而在腫瘤細胞中Bcl-2表達增高,且與細胞的分化程度有關［15-16］。Caspase家族是腫瘤細胞凋亡起始和執(zhí)行過程中非常重要的一系列蛋白因子,是細胞凋亡的核心,caspase家族與Bcl-2家族互相影響。Bcl-2抗凋亡相關蛋白可通過抑制線粒體膜電位、抑制caspase的活化。caspase-3是caspase家族中關鍵的凋亡執(zhí)行者,caspase-8、caspase-9是其中的重要蛋白,且procaspase-8、procaspase-9等分別從不同角度參與調控細胞凋亡［17］。青蒿琥酯能夠抑制多種腫瘤細胞的生長,并促進其凋亡,其作用機制可能與降低細胞線粒體膜電位,啟動內源性線粒體凋亡途徑,增高 Bax、caspase-9及 caspase-3蛋白表達,降低Bcl-2蛋白表達等相關。但由于細胞凋亡的發(fā)生機制很復雜,引起細胞凋亡的因素很多,且既往的研究多為體外實驗,因此,青蒿琥酯抗腫瘤的體內作用機制還有待進一步研究。

3 討論

青蒿琥酯作為青蒿素的水溶性衍生物,除了具有抗瘧作用外,還有許多新作用,而其抗腫瘤作用更是引起人們的廣泛關注,臨床應用前途廣泛。隨著其抗腫瘤作用的不斷深入探索和臨床研究的開展,青蒿琥酯應用于多種腫瘤的治療前景廣闊。

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(編校:譚玲)

Research progresses of artesunate in inducing tumor cell apoptosis

JIANG Hong-yan,YAO An-gui△,JIANG Shang-fei

(College of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 400030,China)

In recent years,studies have shown thatartesunate has anti-tumor activity,and could inhibit gastric cancer,esophageal cancer,colon cancer,liver cancer,melanoma,myeloma cell proliferation and induce apoptosis mechanisms including to start within endogenous mitochondrial apoptotic pathway,increase Bax,caspase-9 and caspase-3 protein expression,and reduce Bcl-2 protein expression and so on.In this paper,the effect and mechanism of artesunate inducing tumor cell apoptosis are reviewed.

artesunate;tumor cell;apoptosis

TN248.1

A

1005-1678（2014)06-0181-03

重慶市教委科研項目(KJ1402601)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目(2012-1-093)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項目(2012-2-17)

蔣紅艷，女，研究生，副教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：jianghy200568@126.com；姚安貴，通信作者，男，本科，副教授，研究方向：臨床醫(yī)學，E-mail：jianghy200568@sina.com。