雙功能抗體藥物研究進(jìn)展

李鋒，黎曉維，沈倍奮

抗體類(lèi)藥物近 20年來(lái)蓬勃發(fā)展，目前全球上市的抗體藥物已經(jīng)有 40 多個(gè)品種，其治療領(lǐng)域也從傳統(tǒng)的癌癥、自身免疫性疾病逐步擴(kuò)展到抗感染和代謝性疾病等。2013年全球 10 大暢銷(xiāo)藥物中有 6 個(gè)是抗體類(lèi)藥物，包括 3 個(gè)自身免疫病治療性藥物和 3 個(gè)抗腫瘤抗體。單克隆抗體發(fā)展的同時(shí)也開(kāi)啟了對(duì)新結(jié)構(gòu)、新功能抗體藥物的探索，以期進(jìn)一步優(yōu)化抗體藥物功能活性?？贵w糖基化改造（afucosylation）、抗體-藥物偶聯(lián)（antibody drug conjugate，ADC）、雙功能抗體（bispecific antibodies，BsAb）等都是當(dāng)前抗體藥物研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。單克隆抗體能夠特異性結(jié)合靶抗原上特定的表位，其優(yōu)勢(shì)在于親和力高、專(zhuān)一性強(qiáng)。但傳統(tǒng)抗體僅結(jié)合單一靶點(diǎn)的單一表位，因此其療效受到一定限制。藥理學(xué)研究揭示，多數(shù)復(fù)雜疾病都涉及多種與疾病相關(guān)的信號(hào)通路，例如腫瘤壞死因子 TNF、白介素 6 等多種促炎癥細(xì)胞因子同時(shí)介導(dǎo)免疫炎性疾病，而腫瘤細(xì)胞的增殖往往是由多個(gè)生長(zhǎng)因子受體的異常上調(diào)造成的。單一信號(hào)通路的阻斷通常療效有限，而且容易形成耐藥性。因此，開(kāi)發(fā)能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同靶點(diǎn)的雙功能抗體及其類(lèi)似物，長(zhǎng)期以來(lái)成為新結(jié)構(gòu)抗體研發(fā)的重要領(lǐng)域。早期在免疫原性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抗體質(zhì)量控制等方面的不足，限制了雙功能抗體的進(jìn)一步的發(fā)展。近年來(lái)，上游基因工程抗體和下游生產(chǎn)工藝技術(shù)的改進(jìn)，克服了傳統(tǒng)雙功能抗體的缺陷，從而推動(dòng)了多類(lèi)新型雙功能抗體進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段。目前主要在研的雙功能抗體從作用機(jī)制上可分為雙重信號(hào)阻斷型和抗CD3+T 細(xì)胞介導(dǎo)的雙功能抗體；從結(jié)構(gòu)上可分為由單鏈抗體或 Fab 區(qū)組成的小型抗體和全抗體；從生產(chǎn)工藝上可分為原核或真核表達(dá)、單細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和雙細(xì)胞系表達(dá)結(jié)合體外裝配等方式。本文就雙功能抗體的最新進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 雙功能抗體的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生技術(shù)

雙功能抗體的研究始于 20 世紀(jì) 80年代單克隆抗體技術(shù)誕生后。最初的嘗試是將 2 株表達(dá)不同單克隆抗體的雜交瘤融合，構(gòu)建 4 倍體雜交瘤。但是，兩株異源抗體的輕重鏈隨機(jī)裝配，理論上體系中會(huì)有 10 多種不同組合的抗體存在，為抗體純化和質(zhì)控帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。目前唯一上市的雙功能抗體產(chǎn)品 catumaxomab（商品名 Removab）就是融合來(lái)自大鼠和小鼠分別表達(dá)抗 EpCAM 抗體和抗CD3 抗體的雜交瘤細(xì)胞株獲得的混合型雙功能抗體。利用種屬間抗體輕重鏈結(jié)合能力的差異以及種屬間抗體重鏈與親和層析介質(zhì)蛋白 A 親和力的差異，catumaxomab 成功實(shí)現(xiàn)了高純度雙功能抗體的規(guī)?；a(chǎn)。catumaxomab 的全抗體結(jié)構(gòu)保留了抗體 Fc 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的生物學(xué)功能，抗體Fc 結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞 FcR 受體，F(xiàn)ab 雙臂分別結(jié)合 T 細(xì)胞表面 CD3 分子和癌細(xì)胞表面 EpCAM 受體，所以該項(xiàng)技術(shù)又稱(chēng)為“三功能抗體”（Triomab）。盡管 catumaxomab 已于 2009年被歐盟批準(zhǔn)上市用于治療 EpCAM 陽(yáng)性腫瘤所引起的惡性腹水，但鼠源抗體的高免疫原性大大限制了其臨床應(yīng)用[1]。

為了解決將兩個(gè)不同的人源化半抗體進(jìn)行正確裝配的問(wèn)題，研究者們?cè)O(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了多種結(jié)構(gòu)的雙功能抗體。首先是將兩個(gè)單鏈抗體（scFv）或者兩個(gè) Fab 通過(guò)肽段 linker 鏈接，形成雙功能抗體片段。具有代表性的是德國(guó) Micromet公司開(kāi)發(fā)的 BiTE（bispecific T-cell engager）系列產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品是將抗 CD3 單鏈抗體與不同抗腫瘤細(xì)胞表面抗原單鏈抗體通過(guò)肽段進(jìn)行連接獲得的[2]。這類(lèi)抗體結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是分子量小、可以在原核細(xì)胞中表達(dá)、不需要考慮正確裝配的問(wèn)題；缺點(diǎn)是由于沒(méi)有抗體 Fc 段，不能介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能、半衰期短等，因而臨床應(yīng)用受到一定限制。

另外一種可以保留抗體的 Fc 結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)是在正?？贵w輕重鏈的 N-末端分別再接入另一個(gè)抗體的 VL和 VH，通過(guò)兩個(gè)抗體可變區(qū)結(jié)合雙靶點(diǎn)，稱(chēng)作 DVD（dual-variable domain）結(jié)構(gòu)抗體。由于引入了額外的抗體可變區(qū)，其分子量大于正常 IgG 抗體[3]。

為了避免臨床上未知的免疫原性等副作用，雙功能抗體應(yīng)盡量避免引入額外的連接肽段和結(jié)構(gòu)域，采取接近正常抗體的結(jié)構(gòu)。通過(guò)改造抗體 CH3 區(qū)的氨基酸序列，形成有利于異種半抗體相互配對(duì)的結(jié)構(gòu)，可以在構(gòu)成雙功能抗體的同時(shí)又盡可能地保持正?？贵w的結(jié)構(gòu)。較典型的是“杵臼”結(jié)構(gòu)抗體（knob-in-hole），具體方法是將其中一個(gè)抗體的重鏈CH3 區(qū) 366 位體積較小的蘇氨基酸殘基 T 突變?yōu)轶w積較大的色氨酸殘基 W，形成突出的“杵”型結(jié)構(gòu)；同時(shí)將另一個(gè)抗體重鏈 CH3 區(qū) 407 位較大的酪氨酸殘基 Y 突變成最小的丙氨酸 A，形成凹陷的“臼”型結(jié)構(gòu)；利用“杵臼”結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩種不同抗體重鏈間的正確裝配。由于抗體輕鏈通常對(duì)其結(jié)合活性影響較小，通過(guò)兩類(lèi)抗體共用序列相同的輕鏈，以保證輕鏈的正確裝配。在單細(xì)胞系表達(dá)此類(lèi)雙功能抗體，分泌的產(chǎn)品正確裝配率高達(dá) 92%，能夠滿(mǎn)足規(guī)模化生產(chǎn)的要求。但重鏈 CH3 的這一改構(gòu)方式降低了抗體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為了克服這一缺點(diǎn)，通過(guò)噬菌體展示庫(kù)技術(shù)篩選不同結(jié)構(gòu)，最終將“臼”型結(jié)構(gòu)改進(jìn)為更穩(wěn)定的 3 個(gè)氨基酸突變（T366S、L368A、Y407V）形式[4]。在單細(xì)胞系中表達(dá)“杵臼”結(jié)構(gòu)抗體，要求兩個(gè)抗體共用同序列輕鏈，會(huì)在一定程度上影響抗體的親和力。為了解決不同輕鏈正確裝配的問(wèn)題，近年來(lái)又開(kāi)發(fā)了雙細(xì)胞系分別表達(dá)半抗體、體外裝配的新工藝。受到人體 IgG4 抗體在生理?xiàng)l件下自然發(fā)生的半抗體隨機(jī)交換過(guò)程的啟示，GenMab 公司開(kāi)發(fā)了 FAE（Fab-arm exchange）雙功能抗體技術(shù)[5]。在兩個(gè)目標(biāo)抗體 IgG1 重鏈 CH3 區(qū)分別引入 K409R 和F405L 兩個(gè)點(diǎn)突變，就能夠形成類(lèi)似于IgG4 抗體的半抗體交換重排。將突變后的兩個(gè)不同 IgG1 抗體在兩個(gè) CHO細(xì)胞系中分別表達(dá)并完成半抗體輕重鏈間的裝配，經(jīng)過(guò)蛋白A 親和純化后，利用溫和的氧化劑系統(tǒng)可在體外實(shí)現(xiàn)異源半抗體之間的精確裝配。該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn) 1500 L 規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[5]。相似的生產(chǎn)技術(shù)也可以應(yīng)用于“杵臼”結(jié)構(gòu)雙功能抗體的生產(chǎn)。除了共用序列相同的輕鏈或進(jìn)行體外裝配，通過(guò) Crossmab 技術(shù)也可促進(jìn)抗體輕鏈的正確裝配。代表產(chǎn)品是羅氏公司正在進(jìn)行 I 期臨床研究的 Ang-2/VEGF CrossMabCH1-CL。Crossmab 技術(shù)是在“杵臼”改造的基礎(chǔ)上，將 Ang-2 抗體 Fab 結(jié)構(gòu)域中的 CL 與 CH1 互換，而VEGF 抗體的 Fab 結(jié)構(gòu)則保持不變。經(jīng)過(guò)改造的 Ang-2抗體輕鏈不易與 VEGF 抗體的重鏈發(fā)生錯(cuò)配，同時(shí)“杵臼”結(jié)構(gòu)可促進(jìn)兩條重鏈異源二聚化[6]。除“杵臼”結(jié)構(gòu)之外，還可通過(guò) IgG 和 IgA CH3 的鏈交換（strand-exchange engineered domain，SEED）技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同半抗體的 Fc 配對(duì)[7]。

基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展特別是噬菌體展示庫(kù)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可對(duì)抗體結(jié)合表面進(jìn)行重塑，從而賦予其結(jié)合第二抗原的高親和力，通過(guò)該技術(shù)所構(gòu)建的雙功能抗體稱(chēng)為 DAF（dual action fab）。文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)對(duì)赫賽汀抗體（Herceptin）輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的氨基酸序列進(jìn)行改造，在保持對(duì) HER2 抗原結(jié)合能力的條件下，成功獲得了對(duì) VEGF 抗原的親和力；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步親和力成熟后，DAF 抗體對(duì)抗原 HER2 和 VEGF 的親和力分別達(dá)到 0.2和 3 nmol/L[8]。與其他雙功能抗體利用不同的半抗體可變區(qū)結(jié)合各自靶抗原不同，DAF 雙功能抗體的雙臂可變區(qū)序列相同但又可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原，因而完全保持了正常 IgG抗體的結(jié)構(gòu)，不降低其穩(wěn)定性，而且可以應(yīng)用常規(guī)抗體表達(dá)生產(chǎn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其在下游生產(chǎn)工藝、制劑開(kāi)發(fā)和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)等方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。

2 雙功能抗體的作用機(jī)制

2.1 介導(dǎo) T 細(xì)胞殺傷

雙功能抗體的一個(gè)重要機(jī)制是介導(dǎo) T 細(xì)胞殺傷。近年來(lái)，隨著對(duì)癌細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入和腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）的興起，激活 T 細(xì)胞的抗體藥物研究備受重視。通常認(rèn)為有效激活 T 細(xì)胞需要雙重信號(hào)，第一信號(hào)來(lái)自抗原提呈細(xì)胞上 MHC-抗原復(fù)合物與 T 細(xì)胞受體 TCR-CD3 的結(jié)合，第二信號(hào)為 T 細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性共刺激信號(hào)。由于多數(shù)癌細(xì)胞表面的 MHC 的表達(dá)下調(diào)甚至缺失，從而逃逸免疫殺傷。CD3×雙功能抗體則能夠分別結(jié)合 T 細(xì)胞表面 CD3 分子和癌細(xì)胞表面抗原，從而拉近細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（cytotoxic T cell，Tc 或 CTL）與癌細(xì)胞的距離，引導(dǎo) T 細(xì)胞直接殺傷癌細(xì)胞，而不再依賴(lài)于 T 細(xì)胞的雙重激活信號(hào)。CD3×雙功能抗體獨(dú)特的 T 細(xì)胞激活方式被認(rèn)為是其作用機(jī)制上的重大優(yōu)勢(shì)[2]。

目前與 CD3 抗體偶聯(lián)的雙功能抗體靶點(diǎn)有 10 余個(gè)，除已經(jīng)上市的 CD3×EpCAM 雙功能抗體外，CD19、CD20、Her2、CEA 等靶點(diǎn)的雙功能抗體品種也已進(jìn)入臨床研究。其中最受關(guān)注的是美國(guó) Amgen 公司與德國(guó) Micromet公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)的 BiTE 結(jié)構(gòu) CD3×CD19 雙功能抗體blinatumomab[9]。該抗體正在進(jìn)行 III 期臨床研究，用于治療急性前 B 淋巴細(xì)胞白血?。˙-precursor ALL）。blinatumomab通過(guò)介導(dǎo) T 細(xì)胞特異性殺傷 CD19 陽(yáng)性 B 淋巴癌細(xì)胞發(fā)揮作用，具有療效好、劑量低的臨床優(yōu)勢(shì)。美羅華抗體治療淋巴癌的臨床用量為 375 mg/(m2?w)，4 周/療程，而blinatumomab 的臨床劑量?jī)H為 5～15 μg/(m2?d)，每個(gè)療程連續(xù)靜脈注射 28 d。在參加 II 期臨床實(shí)驗(yàn)的 25 名患者中，有 17 名患者（占 68%）在前兩個(gè)療程中取得了血液學(xué)完全緩解（complete remission，CR）或血液學(xué)部分緩解（CR with partial hematological recovery），微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）水平小于 10-4。由于BiTE 結(jié)構(gòu) CD3×雙功能抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，blinatumomab 在臨床上的不足也很明顯。除前述由于單鏈抗體半衰期短，臨床上需要長(zhǎng)期連續(xù)靜脈注射之外，CD3 抗體與 T 細(xì)胞結(jié)合后引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，引起臨床較高的副反應(yīng)發(fā)生率。目前介導(dǎo) T 細(xì)胞殺傷的雙功能抗體在血液腫瘤方面顯現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)，但其在實(shí)體瘤方面的療效還有待臨床進(jìn)一步證明。運(yùn)用 Triomab 技術(shù)開(kāi)發(fā)的 CD3×HER2 抗體Ertumaxomab 可應(yīng)用于治療赫賽汀治療后復(fù)發(fā)的乳腺癌，但在進(jìn)入 II 期臨床后即被停止開(kāi)發(fā)。

2.2 雙靶點(diǎn)阻斷

雙功能抗體的另一個(gè)重要的作用機(jī)制是同時(shí)結(jié)合雙靶點(diǎn)，阻斷雙信號(hào)通路。該機(jī)制的應(yīng)用范圍更為廣泛，包括腫瘤、自身免疫性疾病、抑制血管生長(zhǎng)和抗感染等方面的治療。以在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的跨膜酪氨酸激酶受體 HER 家族為例，該家族包括 HER1（erbB1、EGFR），HER2（erbB2、NEU），HER3（erbB3）及 HER4（erbB4）等成員，在很多上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞表面異常高表達(dá)，是腫瘤靶向治療的重要靶點(diǎn)。已經(jīng)上市的抗體有結(jié)合 HER2 D4 結(jié)構(gòu)域的赫賽汀單抗、結(jié)合 HER2 D2 結(jié)構(gòu)域的帕妥珠單抗（Perjeta）以及結(jié)合 HER1/EGFR 的愛(ài)必妥單抗（Erbitux）等，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體瘤的臨床治療。研究揭示，HER 家族成員自身或不同成員之間的同源或異源二聚體激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)展。赫賽汀抗體阻斷 HER2 受體同源二聚，但不能阻斷 HER2 與其他受體間的異源二聚。HER2 與 HER3是 HER 家族激活初始致癌信號(hào)的最強(qiáng)二聚體形式，在臨床上將能夠阻斷該二聚化的帕妥珠單抗與赫賽汀聯(lián)用，取得了比單個(gè)抗體更好的療效，揭示了雙靶點(diǎn)阻斷的臨床效果[10]。

臨床前研究顯示，能夠結(jié)合 HER2 抗原不同結(jié)合域的FAE 結(jié)構(gòu) HER2×HER2 雙功能抗體抑瘤活性?xún)?yōu)于赫賽汀抗體[11]。能夠同時(shí)結(jié)合 EGFR 與 HER3 的 DAF 型雙功能抗體，同樣顯示出優(yōu)于單一靶向 EGFR 抗體 Erbitux 的療效。在自身免疫性疾病治療領(lǐng)域，同時(shí)結(jié)合 IL-13 和 IL-4雙靶點(diǎn)的“杵臼”結(jié)構(gòu) IgG4 亞型雙功能抗體也已經(jīng)進(jìn)入臨床研究[12]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

雙功能抗體的設(shè)計(jì)依賴(lài)于疾病發(fā)病分子機(jī)制、雙功能抗體作用機(jī)制及其副作用機(jī)制的深入研究。該領(lǐng)域仍然有很多待解決的問(wèn)題，如 CD3×雙功能抗體結(jié)合 CD3 后如何避免引起細(xì)胞因子風(fēng)暴、雙靶點(diǎn)親和力如何平衡等。

雙功能抗體在雙重阻斷和誘導(dǎo) T 細(xì)胞腫瘤殺傷的作用機(jī)制等方面具有無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。隨著上游基因工程技術(shù)和下游生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，目前可以構(gòu)建與常規(guī)全抗體分子結(jié)構(gòu)一致或相似的雙功能抗體，并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，為雙功能抗體未來(lái)更廣泛的應(yīng)用鋪平了道路；越來(lái)越多的雙功能抗體進(jìn)入臨床研究?？梢灶A(yù)見(jiàn)，雙功能抗體藥物在未來(lái)將會(huì)成為抗體藥物發(fā)展的新增長(zhǎng)點(diǎn)。

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