單克隆抗體在黑素瘤診斷中的作用

熱依拉·莫合塔爾綜述，康曉靜審校

（1.新疆醫(yī)科大學新疆烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科新疆烏魯木齊830001）

單克隆抗體在黑素瘤診斷中的作用

PNL2 monoclonal antibodies in the diagnosis of melanoma

熱依拉·莫合塔爾1綜述，康曉靜2審校

（1.新疆醫(yī)科大學新疆烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科新疆烏魯木齊830001）

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是原發(fā)于皮膚的高度惡性腫瘤，是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，所以早期診斷和及時治療顯得尤為重要[1]。腫瘤標記物可由腫瘤細胞產生或由非腫瘤細胞，如與腫瘤有關的免疫系統(tǒng)產生，可存在于細胞內或細胞表面[2]。因血清腫瘤標記物的檢測簡便易行,所以在腫瘤學中的應用日益廣泛，但在黑色素瘤中大多數血清腫瘤標記物的敏感性和特異性均不高，且大多數在疾病晚期才高表達，因而不適于早期和亞臨床期[3]。新的黑素瘤生物標記物的發(fā)現及其臨床應用價值的研究具有重要意義，可為黑色素細胞瘤建立一種更加準確的具有治療意義的腫瘤分期和分類方法[4]。

1 免疫組織化學在黑素瘤診斷中的作用

1.1 黑素瘤診斷中存在的問題及解決方案：盡管大多數黑素瘤通過臨床表現、組織病理檢查即可診斷，但仍然有部分的原發(fā)黑素瘤和轉移性惡性黑素瘤難以診斷及識別其組織來源，需要借助免疫組織化學幫助診斷?？购谒亓鱿嚓P抗原單克隆抗體因此成為輔助診斷惡性黑素瘤的有力工具，即便是以無色素性黑素瘤為表型的黑素瘤也不例外。

1.2 抗黑素瘤相關抗原抗體在診斷黑素瘤中的作用：S-100蛋白（S100 proteins，S-100）是一種鈣結合蛋白，抗S-100蛋白抗體對黑素細胞和黑素瘤染色靈敏性高，但特異性不高，人類黑色素瘤-45（Human Melanoma Black-45，HMB-45）識別黑素小體特異性糖蛋白GP100對黑素細胞有很高的特異性[5]。但其應用受染色異質性和靈敏性較S-100差的限制，且假陰性率高達35%，黑素A (MelanA)/黑素瘤抗原-1(melanoma antigen recognized by T-cells 1,MART-1)和酪氨酸酶(Tyrosinase)在轉移性黑素瘤中也有10%～15%不表達相反，敏感的標記物小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，存在許多亞型并在其他組織中表達，因此，陽性結果不一定反映黑素瘤。故此,不能單獨應用某一種抗體診斷黑素瘤。所以,到目前為止還沒有在靈敏性和特異性上都令人滿意的抗體[6-7]。

2 PNL2的基本性質

2.1 PNL2的性質:Rochaix等[8]于2003年首次提出PNL2可作為黑素瘤細胞標志物。接著Kurotaki等[9-10]證實PNL2蛋白對人類和白化鼠黑素瘤具有診斷價值,可PNL2蛋白的基因組研究、確切作用機制及過程尚未發(fā)現。

2.2 PNL2單克隆抗體的制備:Rochaix等[8]指出PNL2單克隆抗體的制備，是在BALB/C（人源化小鼠的代號）小鼠腹膜內注射耦合類人生長抑素受體2與谷胱甘肽S-轉移酶C末端部分的重組蛋白后，經過一段時間免疫克隆產生的抗體。非免疫球蛋白產生的骨髓瘤細胞系P3×63 Ag8-653也作為配偶體，經過標準技術參與PNL2單克隆抗體的產生。并通過人胰腺和扁桃體的冰凍切片的ELISA活性和間接免疫過氧化物酶方法的聚鏈反應測試出上清液中的抗體。最后根據制造商的協(xié)議使用同系小鼠單克隆抗體分型試劑盒進行同種型抗體鑒定。

3 PNL2在黑素瘤診斷中的作用

3.1 不同物種的PNL2蛋白與黑素瘤的關系：Kurotaki等[9]研究表明，PNL2可作為診斷人類、小鼠和白化鼠黑素瘤的標志物，得出PNL2是最近產生的單克隆抗體（mAb）識別正常和腫瘤黑素細胞，但PNL2識別的抗原目前仍未發(fā)現。Giudice等[11]首次采用PNL2來檢測犬黑素細胞抗原。通過對PNL2在犬黑素瘤免疫反應進行測試（4例犬的原發(fā)性黑素瘤，2例為口腔黑素瘤，2例為甲床黑素瘤），并與Melan A進行比較。并采用正常的犬組織和非黑素瘤作為陰性對照，對犬黑素瘤的冷凍樣品進行福爾馬林固定、石蠟包埋后通過Western blot分析黑素細胞與PNL2和Melan A免疫反應性。Western blot檢測證實犬黑素瘤中PNL2抗體蛋白的存在。PNL2免疫組化染色的犬黑素瘤細胞胞漿內出現顆粒狀花紋。在所測試的黑素細胞腫瘤，PNL2陽性率為62.0%，Melan A為59.0%；兩種單克隆抗體染色皆陽性50.7%。這兩種抗體染色至少有一種抗體陽性的例數占68.0%。使用PNL2染色顯色范圍比Melan A更大。類似人類粒細胞，犬粒細胞的黑素瘤的PNL2染色分別采用Western blot和免疫組化分析均為陰性。可見，PNL2單抗在福爾馬林固定的犬黑素細胞腫瘤的識別中仍然是一個有價值的診斷試劑。犬和人類黑素瘤中提取物與PNL2的免疫染色顯示類似的結果，這表明人和犬這兩個不同的物種的黑素細胞中存在能與PNL2反應的相同蛋白質。人的粒細胞也能與PNL2反應，其結果是與以往Rochaix等[8]發(fā)表的結論一致，但狗粒細胞卻沒有參與PNL2單克隆抗體交叉反應。這研究表明在狗中分布著與人不同的PNL2蛋白質。

3.2 PNL2與原發(fā)性黑素瘤和特殊非黑素瘤：Rochaix等[8]首次提出PNL2是一種新的單克隆抗體、主要針對抗黑素細胞抗原。他們研究發(fā)現,PNL2免疫染色標記廣泛應用于正?；驉盒匀祟惤M織和各種黑素細胞病變范圍的分析，有很高的特異性。給予皮膚和口腔黏膜黑素細胞的細胞質和粒細胞染色時，PNL2顯示高濃度。在不同的痣組織學類型,如：皮內痣、表皮痣和混合痣，PNL2染色大多數都是陰性，只有散在分布的痣細胞在其真皮乳頭層才能被標記。標記原發(fā)黑素瘤時，不管黑素瘤的組織學類型分型如何，PNL2的陽性率都在70%以上。Busam等[12]分析PNL2在各種正常組織、黑素細胞痣、原發(fā)黑素瘤以及非黑素瘤，包括黑素瘤的組織學類癌以及血管肌脂瘤，并檢測不同的腫瘤類型派生的多種細胞系的免疫反應性。他們采用傳統(tǒng)的石蠟組織切片和幾種組織微陣列板,檢測PNL2、Melan A/MART-1(A103)、Tyrosinase(T311)、HMB-45（GP100）和MITF（D5）在黑素瘤中的免疫反應。PNL2陽性染色出現在正常黑素細胞、嗜中性粒細胞及黑素細胞病變良性痣以及原發(fā)性惡性黑素瘤尤其是上皮樣的變體，均常用免疫陽性，但不包括其他正常的細胞類型。除了血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和惡性異型外周神經鞘瘤（屬于惡性Triton腫瘤）這三種非黑素瘤的PNL2的免疫染色陽性，其余非黑素瘤均為陰性。因此，他們都得出PNL2可作為黑素瘤診斷的補充試劑。

Rochaix等[8]還發(fā)現同抗Melan A和HMB-45抗體一樣，PNL2能染色標記大部分透明細胞肉瘤細胞，還有一些血管平滑肌脂肪瘤和淋巴管平滑肌瘤細胞。非黑素細胞病變不能被標記。蛋白質組化途徑表明，免疫親和純化PNL2結合復合體可以從黑素瘤細胞系中分離出來，黑素瘤細胞系包括TAP1、網格蛋白17和前白蛋白等蛋白質，但不包括能被HMB-45識別標記的GP100?？梢?，PNL2作為新的單克隆抗體，專門針對黑素細胞相關抗原。即使黑色素被漂白或脫鈣后染色，PNL2仍能識別出黑素細胞相關抗原。PNL2染色標記模式和HMB-45相似，與Melan A和GP100不同。另外，Nonaka等[13]在35例含有大量壞死惡性黑素瘤的病灶的研究中指出，S-100作為最敏感的標記物（靈敏度高達97%），但壞死區(qū)域表現出非特異性染色，HMB-45、Melan A、Tyrosinase、PNL2的免疫染色陽性率分別為71%、80%、86%、66%，PNL2需聯(lián)合HMB-45和Tyrosinase，靈敏度才可增加至80%，提高免疫標記物診斷黑素瘤的價值。

3.3 PNL2與轉移性黑素瘤：Rochaix等[8]證實PNL2能標記所有轉移性黑素瘤，但標記細胞顯示陽性的概率有時低于原發(fā)黑素瘤。Busam等[12]則得出相比A103、HMB45、T311及D5檢測轉移性黑素瘤靈敏度分別為82%、76%、92%和84%；PNL2檢測轉移性黑素瘤靈敏度較高為87%。且聯(lián)用五種試劑在檢測轉移性黑素瘤時免疫陰性的病例將會明顯減少。Aung等[14]在大量轉移性惡性黑素瘤(214例)、結締組織增生性黑素瘤(34例)、胃腸道黏膜黑素瘤(54例)、良性色素痣(27例)、透明細胞肉瘤(16例)和非黑色素腫瘤(1218例)進行免疫組化研究發(fā)現，PNL2在轉移性黑素瘤表達為89.2%，另外，在7例S-100陰性表達的轉移性黑素瘤中，PNL2有6例表達陽性。在黏膜黑素瘤中，PNL2陽性率為89%(48/54)，PNL2結締組織增生性黑素瘤的敏感陽性率僅為6%(2/34)?？梢姡琍NL2可作為轉移性黑素瘤診斷的補充標記物。

3.4 PNL2與結締組織增生性黑素瘤：Rochaix等[8]得出PNL2不能標記結締組織增生性黑素瘤。Busam等[12]則得出僅1/13結締組織增生性黑素瘤的PNL2免疫染色陽性。Aung等[14]發(fā)現KBA62在結締組織增生性黑素瘤的敏感指標為82%（34例中28例陽性），可見，KBA62在診斷結締組織增生性黑素瘤時可替代PNL2，以提高靈敏度。

3.5 PNL2與黏膜黑色素瘤：Aung等[14]的研究發(fā)現在黏膜黑素瘤中，PNL2陽性率很高，可替代陰性率較高的S-100、KBA62等免疫標記物。由于位于頭部和頸部的黏膜黑素瘤的組織學診斷較為困難，且免疫組化染色在皮膚病變的染色標記結果并不可靠。Morris等[10]首次采用PNL2染色標記9例均起源于鼻腔鼻竇黏膜黑素瘤（福爾馬林固定）的試驗結果顯示，4例彌漫性陽性染色中PNL2陽性率為77.8%，HMB-45為77.8%，Melan A為50%，S-100為87.5%和MITF為40%。另外3例PNL2染色優(yōu)于Melan A和MITF。類比HMB-45對黏膜黑素瘤的高靈敏度，PNL2對黏膜黑素瘤的靈感度較高，優(yōu)于Melan A和MITF，且特異性優(yōu)于S-100。因此，Morris等[10]提出PNL2可作為頭頸部黏膜黑素瘤診斷的重要輔助指標。

免疫組化是一種廣泛用于日常病理診斷試驗的檢測技術，具有精確、快速、低費用的特點[15]。PNL2是一種研究較少的黑素瘤相關抗原單克隆抗體。PNL2對正常人皮膚黑素細胞、良性和惡性增殖的黑素細胞中染色呈強陽性，除血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和惡性異型外周神經鞘瘤這三種非黑素瘤陽性外，PNL2均為陰性。PNL2對黏膜黑素瘤的靈感度較高，但結締組織增生性黑素瘤的靈敏度較低。鑒于其對黑素瘤普遍高特異性，更多有關PNL2蛋白以及基因組的研究應該受到人們的重視，以增加這種標記物的臨床應用，并有望用于黑素瘤的靶向治療、預后判斷、指導患者用藥及為黑素瘤患者提供最佳的個體化治療方案。

[1]Ordó nezNG.Valueofmelanocytic-associated immunohistochemical markers in the diagnosis of malignant melanoma:a review and update[J].Hum Pathol，2014,45(2): 191-205.

[2]Lade-KellerJ,Riber-HansenR,GuldbergP，etal. Immunohistochemicalanalysisofmoleculardriversin melanoma identifies p16 as an independent prognostic biomarker[J].J Clin Pathol，2014，67(6):520-528.

[3]MargaritescuI,ChiriTaAD.Desmoplasticmelanomachallenges in the diagnosis and management of a rare cutaneous tumor[J].Rom J Morphol Embryol，2014，55(3): 947-952.

[4]Lade-KellerJ,Riber-HansenR,GuldbergP，etal. Immunohistochemicalanalysisofmoleculardriversin melanoma identifies p16 as an independent prognostic biomarker[J].J Clin Pathol，2014，67(6):520-528.

[5]Lukanidin E，Sleeman JP．Building the niche：the role of the S100 proteins in metastatic growth[J].Semin Cancer Biol，2012，22(3)：216-225.

[6]Ramos-VaraJA,FrankCB,DuSoldD,etal. Immunohistochemical expression of melanocytic antigen PNL2,Melan A,S100,and PGP 9.5 in equine melanocytic neoplasms[J].Vet Pathol,2014,51(1):161-166.

[7]Ivan D,Prieto VG.Use of immunohistochemistry in the diagnosis of melanocytic lesions:applications and pitfalls [J].Future Oncol，2010，6(7):1163-1175.

[8]Rochaix P,Lacroix-Triki M,Lamant L,et al.PNL2,a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistant melanocyte antigen[J].Mod Pathol,2003，16:481-490.

[9]KurotakiT,TomonariY,KannoT,etal.Anovel immunohistochemical marker of normal and neoplastic melanocytes in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues of albino rats[J].Vet Pathol,2008,45:383-387.

[10]Morris LG,Wen YH,Nonaka D,et al.PNL2 melanocytic marker in immunohistochemical evaluation of primary mucosal melanoma of the head and neck[J].Head Neck，2008,30:771-775.

[11]GiudiceC1,CecilianiF,RondenaM,etal. Immunohistochemical investigation of PNL2 reactivity of canine melanocytic neoplasms and comparison with Melan A[J].J Vet Diagn Invest，2010,22(3):389-394.

[12]Busam KJ,Kucukgol D,Sato E，et al.Immunohistochemical analysisofnovelmonoclonalantibodyPNL2and comparison with other melanocyte differentiation markers [J].Am J Surg Pathol，2005,29(3):400-406.

[13]Nonaka D,Laser J,Tucker R,et al.Immunohistochemical evaluation of necrotic malignant melanomas[J].Am J Clin Pathol，2007,127(5):787-791.

[14]Aung PP,Sarlomo-Rikala M,Lasota J,et al.KBA62 and PNL2:2 new melanoma markersimmunohistochemical analysis of 1563 tumors including metastatic，desmoplastic，and mucosalMelanomas and their mimics[J]．Am J Surg Pathol，2012，36(2):265-272．

[15]郭芳,康曉靜.新疆地區(qū)80例惡性黑素瘤BRAF基因突變分析[J].中華皮膚科雜志，2013,46（1）：33-36.

2014-11-17

2014-12-15

編輯/李陽利

國家自然科學基金項目（81250023）；2012年度留學人員回國創(chuàng)業(yè)項目

康曉靜，女，博士生導師；研究方向：皮膚腫瘤和遺傳性皮膚病