多花黃精嫩莖與根莖芽離體培養(yǎng)技術(shù)

周新華，曾滿生，肖智勇，李峰卿，周志蘭，鐘秋平

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600；2.宜春市林業(yè)科學(xué)研究所，江西 宜春 336000)

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua是百合科黃精屬藥食同源的多年生草本植物，其根莖是我國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效[1-2]。多花黃精主要分布在四川、貴州、湖南、湖北、河南、江西、安徽、浙江、福建、廣東等省份，生長(zhǎng)在林下、灌叢或山坡陰處，海拔500～2 100m[3]。在人工栽培中由于受種子收集難度大、發(fā)芽率低下、育苗周期長(zhǎng)等因素影響，多花黃精通過(guò)有性繁殖的方式無(wú)法滿足生產(chǎn)需要。而無(wú)性繁殖作為保持母本優(yōu)良性狀和快速繁育的重要手段，可有效地解決優(yōu)良種源性狀固定和利用這一難題。與扦插、嫁接等常規(guī)無(wú)性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)具有不受季節(jié)、取材數(shù)量等因素制約的優(yōu)勢(shì)，可在短期內(nèi)規(guī)模繁殖性狀穩(wěn)定的優(yōu)良種苗[4-5]。利用組培手段培育出來(lái)的種苗，不僅保持了母本的優(yōu)良性狀、增加了繁殖材料、縮短了育苗周期，還可為建立優(yōu)良苗圃繁育基地節(jié)省育苗成本。因此，開展多花黃精的離體組織培養(yǎng)和芽增殖技術(shù)研究非常有必要。

國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究集中于多花黃精的芽體外發(fā)生、根莖芽增殖和株體生根等組織離體培養(yǎng)技術(shù)[6-11]，結(jié)果表明不同外植體材料的組織部位、年齡和培養(yǎng)基成分是影響多花黃精組培成功與否的關(guān)鍵。植物材料組織培養(yǎng)按器官發(fā)生途徑，通?？煞譃槠鞴僦苯影l(fā)生途徑和器官間接發(fā)生途徑2種類型。直接發(fā)生途徑以芽為外植體，獲得的植株具有穩(wěn)定性好、自然變異頻率低、適應(yīng)性強(qiáng)和移栽成活率高等優(yōu)點(diǎn)[12]。但芽增殖系數(shù)不高一直是制約多花黃精器官直接再生組織培養(yǎng)途徑的主要因素，因此探索提高芽的誘導(dǎo)和增殖效率是當(dāng)前多花黃精組織培養(yǎng)過(guò)程中迫切需要解決的問(wèn)題。

本試驗(yàn)中以野生多花黃精的嫩莖和休眠芽為材料，進(jìn)行植物組織器官直接發(fā)生的離體培養(yǎng)技術(shù)研究，探索適合大崗山山區(qū)野生多花黃精嫩莖和根莖芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基，以期為構(gòu)建多花黃精高效、穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系，規(guī)?；a(chǎn)多花黃精組培苗提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以江西省分宜縣中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心年珠林場(chǎng)大崗山山區(qū)選育的生長(zhǎng)性狀表現(xiàn)優(yōu)良的野生多花黃精為研究對(duì)象，選取嫩莖和休眠根莖芽2種外植體為研究材料。該批植株是于2010年從大崗山山區(qū)選育移栽到試驗(yàn)基地的試驗(yàn)材料，2012年底將多花黃精塊莖移至亞林中心生物工程部進(jìn)行沙藏處理，方便取材，嫩莖取材約10cm作為外植體誘導(dǎo)材料，根莖芽從塊莖上切取新萌芽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅 菌

先用體積分?jǐn)?shù)為75％酒精進(jìn)行表面滅菌，然后采用15％次氯酸鈉和0.1％氯化汞進(jìn)行深度滅菌，酒精滅菌處理時(shí)間為分別15、30s，次氯酸鈉和氯化汞滅菌處理時(shí)間分別為6、8、10min，滅菌采用多因素滅菌試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。將取得的長(zhǎng)約10cm的嫩莖材料，剪成長(zhǎng)3～5cm(1～2節(jié))的細(xì)段放入燒杯中，用洗潔精浸泡洗滌15min，然后用自來(lái)水沖洗1h以上。之后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌試驗(yàn)，處理完成后用無(wú)菌水沖洗4次以上，接入MS培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計(jì)污染情況，并算出每個(gè)處理相應(yīng)的無(wú)菌率。

無(wú)菌率=無(wú)菌瓶數(shù)/接種總瓶數(shù)。

1.2.2 嫩莖和根莖芽誘導(dǎo)

選用無(wú)外源激素的MS、White和H等3種基本培養(yǎng)基開展嫩莖和根莖芽的萌發(fā)試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。滅菌后的嫩莖和根莖芽分別接種在上述3種培養(yǎng)基中，45d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的芽數(shù)，并計(jì)算平均萌發(fā)芽數(shù)。

平均萌發(fā)芽數(shù)=萌發(fā)的總芽數(shù)/接種的總瓶數(shù)。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)

MS培養(yǎng)基的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基高，被廣泛應(yīng)用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果較好[13]。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)處理采用萘乙酸(NAA)和激動(dòng)素(KT)2種植物生長(zhǎng)激素，0.5～2.0mg/L不同質(zhì)量濃度激素處理的雙因素試驗(yàn)，共計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。將根莖芽剝?nèi)ネ饷?～4層后，洗潔精浸泡洗滌15min，自來(lái)水沖洗1h以上，超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精處理15s，用無(wú)菌水沖洗3次，用0.1％的氯化汞處理10min，用無(wú)菌水沖洗4次以上，剝?nèi)ネ饷?層，接種在不同處理的MS培養(yǎng)基中。45d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)不定芽的數(shù)量，并計(jì)算平均增殖數(shù)。

平均增殖數(shù)＝萌發(fā)不定芽總數(shù)/接種總芽數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件

組培室培養(yǎng)條件為：溫度控制在(24±2)℃，光照強(qiáng)度控制在1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間12h，濕度控制在70％左右。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。多重比較采用顯著系數(shù)0.05上的Duncan多范圍檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)數(shù)據(jù)都在同一量綱上進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對(duì)外植體滅菌效果的影響

先以酒精處理進(jìn)行表面滅菌，然后以次氯酸鈉或氯化汞處理進(jìn)行深度滅菌的混合處理滅菌方法，不同外植體滅菌處理的滅菌效果不同(見(jiàn)表1)。表1中結(jié)果顯示，75％的酒精處理30s、0.1％氯化汞處理10min外植體滅菌效果最好，無(wú)菌率高達(dá)73.2％；其次是75％的酒精處理30s、0.1％氯化汞處理8min，外植體消毒無(wú)菌率達(dá)到64.8％。氯化汞是一種有劇毒的重金屬殺菌劑，能使蛋白質(zhì)變性，使酶失活，在常用消毒劑中其滅菌效果最好[12]，本試驗(yàn)中外植體材料來(lái)源于地下部，帶有大量的細(xì)菌和真菌，使用其它消毒劑恐難以達(dá)到較好的滅菌效果。但氯化汞的重金屬殘留會(huì)對(duì)植物造成傷害，廢液亂棄也會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害，故在使用氯化汞進(jìn)行滅菌時(shí)應(yīng)增加對(duì)外植體的沖洗次數(shù)(最好6次以上)，廢棄液采用硫化鈉處理，防止環(huán)境污染。

表1 不同滅菌處理的滅菌效果?Table 1 Effect of different sterilization treatments

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)腋芽萌發(fā)的影響

外植體滅菌后接種在無(wú)外源激素的MS、White和H 3種基本培養(yǎng)基上進(jìn)行腋芽萌發(fā)試驗(yàn)，培養(yǎng)45d后，統(tǒng)計(jì)外植體萌發(fā)的腋芽數(shù)，并計(jì)算單個(gè)外植體的平均萌發(fā)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2中結(jié)果顯示，MS培養(yǎng)基上的外植體腋芽萌發(fā)最好，平均萌發(fā)數(shù)嫩莖1.0個(gè)、根莖芽1.5個(gè)；其次是White培養(yǎng)基，腋芽平均萌發(fā)數(shù)嫩莖0.5個(gè)、根莖芽1.0個(gè)。就外植體不同取材部位而言，根莖芽的萌發(fā)能力要明顯大于嫩莖部位，這與外植體材料不同部位自身的萌發(fā)能力有關(guān)。不同外植體萌發(fā)的腋芽見(jiàn)圖1A和圖1B。

2.3 不同激素質(zhì)量濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

將滅菌后的根莖芽接種在含有不同質(zhì)量濃度激素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)45d后，觀察統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)不定芽數(shù)量，并計(jì)算平均單個(gè)根莖芽上誘導(dǎo)出的平均不定芽數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，NAA和KT單獨(dú)使用時(shí)，以NAA 2.0mg/L和KT 2.0mg/L的不定芽誘導(dǎo)效果最好，2個(gè)處理單個(gè)根莖芽能誘導(dǎo)出不定芽的數(shù)量分別為2.2和2.7個(gè)。在此基礎(chǔ)上，保持NAA和KT激素質(zhì)量濃度在同等水平，進(jìn)行NAA和KT的組合對(duì)根莖芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，激素組合NAA 1.5mg/L＋KT 1.5mg/L對(duì)根莖芽的誘導(dǎo)效果最佳，單個(gè)根莖芽的平均不定芽誘導(dǎo)數(shù)達(dá)6.6個(gè)，使用NAA和KT激素組合均比單獨(dú)使用NAA和KT對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果要好。激素組合誘導(dǎo)出的不定芽見(jiàn)圖1C和圖1D。

表2 不同培養(yǎng)基中外植體萌發(fā)結(jié)果Table 2 Explants germination status in different media

3 結(jié)論與討論

3.1 滅菌方法的選擇

為方便試驗(yàn)獲取嫩莖和根莖芽材料，于11月底將黃精根莖從苗圃地中挖起移至室內(nèi)沙藏處理，沙藏處理時(shí)間長(zhǎng)短和沙粒的滅菌與否對(duì)外植體滅菌后的污染率影響較大。由于本試驗(yàn)中外植體材料長(zhǎng)時(shí)間埋藏在沙中，不可避免取材帶有大量的細(xì)菌和真菌，這是獲取無(wú)菌組織培養(yǎng)材料的一大障礙。為克服這一困難，本試驗(yàn)中在獲取無(wú)菌材料時(shí)，先將材料用洗潔精浸泡洗滌，然后用自來(lái)水沖洗1h以上，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上后用75％的酒精進(jìn)行表面滅菌，再選用消毒能力最強(qiáng)的0.1％氯化汞進(jìn)行滅菌處理效果較好。為減少重金屬殘留對(duì)外植體材料的毒害作用，在滅菌之后用無(wú)菌水沖洗6次以上較好。

表3 MS培養(yǎng)基上不同質(zhì)量濃度激素處理對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of different mass concentration treatments of hormones in MS medium on adventitious buds induction

圖1 多花黃精組織培養(yǎng)腋芽萌發(fā)和不定芽誘導(dǎo)過(guò)程Fig.1 Axillary bud germination and adventitious bud differentiation process in tissue culture of P.cyrtonema

3.2 基本培養(yǎng)基和材料部位的選擇

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體分化和生長(zhǎng)受多種因素的綜合影響，其中培養(yǎng)基的成分和含量以及外植體的取材部位選擇，對(duì)組織培養(yǎng)植物的發(fā)生過(guò)程和生長(zhǎng)形態(tài)均有著顯著影響。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)外植體在無(wú)外源激素的MS、White、H 3種基本培養(yǎng)基上的腋芽萌發(fā)試驗(yàn)，得出MS基本培養(yǎng)基最有利于外植體材料腋芽的萌發(fā)；通過(guò)對(duì)嫩莖、根莖芽在MS、White、H培養(yǎng)基上的腋芽萌發(fā)試驗(yàn)，得出根莖芽的萌發(fā)能力要顯著好于嫩莖的萌發(fā)能力。因此，以MS為基本培養(yǎng)基、根莖芽為材料有利于多花黃精組織離體培養(yǎng)技術(shù)的探索。

3.3 不同激素質(zhì)量濃度的選擇

芽增殖過(guò)程中，最適合腋芽萌發(fā)的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。休眠芽是誘導(dǎo)不定芽的理想材料之一，芽誘導(dǎo)的效果受到材料基因型、樹齡、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等多方面因素影響[14-18]。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)根莖芽在含有不同質(zhì)量濃度NAA和KT的MS培養(yǎng)基上的不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，最終確定最適不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS＋NAA 1.5mg/L ＋KT 1.5mg/L。

在植物組織離體培養(yǎng)過(guò)程中，影響離體組織生長(zhǎng)發(fā)育的因素較多。本試驗(yàn)中著重對(duì)基本培養(yǎng)基、外植體選材部位和外源激素種類和質(zhì)量濃度對(duì)黃精植物組織離體材料的生長(zhǎng)和增殖情況的影響進(jìn)行了初步探索。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上，由于試驗(yàn)規(guī)模和時(shí)間限制，未開展對(duì)培養(yǎng)溫度、光照以及其它基本培養(yǎng)基和多種不同激素及其質(zhì)量濃度組合對(duì)多花黃精生長(zhǎng)和芽增殖的影響探索，在后續(xù)研究中可以采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)方法等，利用快速高效的手段開展進(jìn)一步的探索。

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