植物源ACE抑制肽研究進(jìn)展

郭顯榮 ，黃衛(wèi)文 ，b，龔吉軍 ，b，王 揮 ，李忠海 ，b

(中南林業(yè)科技大學(xué)a.食品科學(xué)與工程學(xué)院；b.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

高血壓是一種常見的心血管疾病。我國有2億人患有高血壓，每年近150萬人因高血壓而死亡，這已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)的高活性被認(rèn)為是導(dǎo)致高血壓的主要原因之一。ACE抑制肽具有抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抑菌等功效，是治療原發(fā)性高血壓和心力衰竭的有效藥物[2-3]?；瘜W(xué)合成的 ACE 抑制劑如巰丙脯氨酸(Captopril)在達(dá)到降血壓目的的同時(shí)往往伴有一定的副作用，如咳嗽、皮疹等[4]。從食物蛋白中水解得到的降血壓肽具有人工合成的降壓藥物不可比擬的高安全性與零副作用的特點(diǎn)，如美國以三文魚加工副產(chǎn)物為原料，水解所得降血壓肽的降壓效果良好。每天攝入1.5g該多肽就能使中等強(qiáng)度高血壓患者的血壓趨于平穩(wěn)，用量少且效果好。來源于植物的ACE 抑制肽在降血壓的過程中表現(xiàn)出明顯的降壓效果且無毒副作用，引起了人們的廣泛關(guān)注[5-7]。

近年來學(xué)術(shù)界對(duì)于植物源ACE抑制肽的研究報(bào)道較多，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)ACE抑制肽在降血壓的作用機(jī)理方面進(jìn)行了深入的研究，在此基礎(chǔ)上，以花生、玉米、菜籽、棉籽、米糠、油茶粕等為原料[8-12]，經(jīng)酶解或發(fā)酵的手段獲得了具有較好ACE抑制活性的多肽片段。但是，從不同植物中獲取的ACE抑制肽的氨基酸序列有所差異，且提取的方式不盡相同，分離純化也較為復(fù)雜，故ACE抑制肽在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中還存在許多問題[13]。因此，高效制備天然、安全、無毒副作用的 ACE 抑制肽已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

1 ACE及ACE抑制肽(ACEI)的作用機(jī)理

ACE是一種含鋅二肽羧基肽酶，其作用機(jī)理(如圖1所示)主要表現(xiàn)在如下兩個(gè)系統(tǒng)中：一是腎素-血管緊張系統(tǒng)(Renin-Angiotension System，RAS)，ACE將血管緊張素I(AngⅠ)轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，而AngⅡ可加強(qiáng)心肌的收縮力，使血壓升高；二是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kalikkrein-Kinin System，KKS)，KKS為降壓系統(tǒng)，其中舒緩激肽可增強(qiáng)毛細(xì)血管的通透性，使血壓下降，而引起高血壓的主要原因是ACE和舒緩激肽發(fā)生反應(yīng)，使位于舒緩激肽C末端的二肽Phe-Arg缺失，成為失活片段。因此，抑制ACE的活性對(duì)于降血壓有著積極的作用，而尋求ACE抑制劑也成為降血壓研究中的熱門話題。

圖1 ACE對(duì)血壓的調(diào)節(jié)及ACEI的作用機(jī)理Fig.1 Mechanisms of ACE regulating blood pressure and ACEI acting

ACEI活性強(qiáng)度主要取決于以下兩個(gè)因素：一是肽段分子量；二是氨基酸組成。據(jù)Mullally等人[14]的研究結(jié)果，具有較高降血壓效應(yīng)的多肽片段的分子量大小主要集中在1kDa以下。至于氨基酸組成與降血壓活性之間的關(guān)系，Cheung等人[15]研究的結(jié)論是，一般肽段含有的疏水性氨基酸越多，其ACE抑制活性越強(qiáng)。當(dāng)C末端為芳香族氨基酸(如Phe、Tyr、Trp或Pro)，N末端為長鏈或含支鏈的疏水性氨基酸(如Leu、Ile、Val)時(shí)，其降血壓活性相對(duì)較強(qiáng)，但若N末端含有Pro，則其降壓活性反而降低。

2 ACEI的制備方法

2.1 酶 法

酶法主要是在溫和的條件下采用蛋白酶催化水解植物蛋白生成具有降血壓活性的多肽片段，該方法所需條件溫和，原料來源廣泛，安全性高，無毒副作用，是制備降血壓肽的主要手段。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃胰蛋白酶、膠原蛋白酶等是目前應(yīng)用于制備降血壓肽研究的主要酶類[16]。

劉 佳 等 人[17]采 用 Protease N、ProteaseS、Alcalase、Protamex、木瓜蛋白酶這五種蛋白酶分別對(duì)中性蛋白酶酶解后的大豆蛋白產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的水解，以期制備更高活性的ACE抑制肽，其研究結(jié)果表明，Protease N是最合適的蛋白酶，即所獲的大豆多肽的ACE抑制活性最高；其最優(yōu)的制備條件為：底物濃度為5％，加酶量為2.0％，pH 值為7.0，溫度為55℃。張曉平等人[18]以燕麥蛋白為原料，選用Neutrase、Protamex 和Alcalase三種蛋白酶分別進(jìn)行單酶水解或自由組合的聯(lián)合水解，其研究結(jié)果表明，單酶反應(yīng)時(shí)，堿性蛋白酶為最適蛋白酶，水解產(chǎn)物燕麥多肽對(duì)ACE的抑制活性較強(qiáng)；而聯(lián)合水解的優(yōu)勢(shì)并不明顯。

2.2 發(fā)酵法

國內(nèi)外的有關(guān)研究結(jié)果表明，發(fā)酵生產(chǎn)ACE抑制肽主要采用液態(tài)發(fā)酵方法，目前用于液體發(fā)酵的菌種主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉。劉顯儒[19]分別采用上述菌種，以米糠為原料，進(jìn)行了單一菌和復(fù)合菌液態(tài)發(fā)酵制備ACE抑制肽試驗(yàn)，結(jié)果表明，復(fù)合菌(枯草芽孢桿菌和黑曲霉)液態(tài)發(fā)酵所制得的米糠多肽對(duì)ACE的抑制活性最高，其最優(yōu)的制備條件為：底物濃度5.0％，時(shí)間22h，溫度34℃，接種比例為2∶1；ACE抑制率為70％。

將以酶法和發(fā)酵法制得的多肽片段進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以期得到降壓效果最好的單一組分。目前應(yīng)用于ACEI分離純化的方法主要有超濾法、凝膠層析色譜法、離子交換層析、高效液相色譜、凝膠電泳等。在對(duì)肽段進(jìn)行分離純化時(shí)，一般會(huì)將分離原理不同的兩種方法或手段結(jié)合起來使用，從而使分離的肽段更純。Ma等人[20]將酶解后得到的蕎麥多肽液進(jìn)行分離純化，首先采用Sephadex G-25陰離子交換層析法對(duì)蕎麥多肽液進(jìn)行初步分級(jí)分離，得到分子量大小不同的四種組分，分別測(cè)其ACE抑制活性，并用IC50(抑制50％ACE活性所用的ACE抑制肽的濃度)來表示，ACE活性抑制最強(qiáng)組分的抑制率為91％，IC50為25.7 μg/mL；然后采用反相高效液相色譜法對(duì)上述組分進(jìn)行進(jìn)一步的純化，其中ACE活性抑制最強(qiáng)組分的抑制率為96％，IC50為6.3 μg/mL。倪莉等人[21]以可溶性素絲粉末為原料，直接用堿性蛋白酶水解，制備了具有較高ACE抑制活性的絲素肽，以質(zhì)譜法檢測(cè)到的其氨基酸組成為Gly-Tyr。但由于ACE抑制肽氨基酸組成的多樣性，肽段長度不同，極性和疏水性也不盡相同，所以有針對(duì)性地設(shè)計(jì)純化方案對(duì)于提高ACE抑制肽的純度非常有效。

3 ACE抑制肽的分析檢測(cè)方法

3.1 體外檢測(cè)方法

目前體外檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法這三種。

紫外分光光度法：Cushman和Cheung[22]于20世紀(jì)70年代建立了以紫外分光光度測(cè)定ACE抑制肽活性的方法。其基本原理是，在37℃、pH為8.3的條件下，利用ACE催化水解馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)生成馬尿酸(Hip)，當(dāng)加入ACE抑制肽時(shí)，催化水解反應(yīng)被抑制，生成的馬尿酸含量減少。由于馬尿酸在紫外228nm處具有特征吸收峰，故可根據(jù)馬尿酸吸收值的大小來衡量ACE的抑制活性。但是，該方法操作較為復(fù)雜，其中HHL在紫外228nm處也有一定的吸收峰，所以檢測(cè)結(jié)果不夠精確，易產(chǎn)生誤差。

高效液相色譜法(HPLC)：2002年Wu等人[23]人改良了Cushman和Cheung的方法，采用高效液相色譜法檢測(cè)ACE抑制活性。該方法利用RP-HPLC系統(tǒng)，采用梯度洗脫的方式，使得HHL和反應(yīng)產(chǎn)生的馬尿酸得到很好的分離，再進(jìn)一步通過紫外檢測(cè)器于228nm的波長下在線檢測(cè)反應(yīng)中馬尿酸吸收值的大小。該方法快捷、簡便，精確度高。 Danny等人[24]將電子質(zhì)譜與液相色譜進(jìn)行耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了降壓肽抑制活性和組成的在線檢測(cè)。

高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法是一種新型的ACEI分析技術(shù)，其原理是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，樣品中各組分的離子或荷電粒子在毛細(xì)管中按其濃度和分配系數(shù)的差異進(jìn)行高效快速的液相分級(jí)分離。2003年，辛志宏等人[25]在以麥胚蛋白為原料制備降血壓肽的研究中，所得降血壓肽活性較高。該法的優(yōu)點(diǎn)在于釆用自動(dòng)進(jìn)樣的方法，避免了人為誤差，溶劑用量少，分析時(shí)間短。

此外，還可以采用薄層掃描法[26]和熒光分光光度法[27]進(jìn)行體外檢測(cè)。

3.2 體內(nèi)檢測(cè)方法

體內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)于評(píng)價(jià)ACE抑制肽活性是不可或缺的。由于SHR的血壓與人類血壓相似，所以采用原發(fā)性高血壓大白鼠(Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)建立的模型是研究降血壓肽較好的動(dòng)物模型[28]，其試驗(yàn)結(jié)果在一定范圍內(nèi)可以作為評(píng)價(jià)降血壓肽生物學(xué)效應(yīng)的參考依據(jù)。在一段時(shí)間內(nèi)定期測(cè)量SHR的動(dòng)脈收縮壓，以此判定ACE抑制肽的降血壓功效。降血壓肽的攝入方法主要采用胃插管法和直接口服兩種方式。攝入周期分為一次性檢測(cè)和長期檢測(cè)兩種：一次性檢測(cè)，主要檢測(cè)SHR攝入降血壓肽前后血壓的變化情況，檢測(cè)時(shí)間一般為2h；長期檢測(cè)，以周或月為時(shí)間單位，幾周或幾個(gè)月連續(xù)攝入ACE抑制肽，同時(shí)以合成的降血壓藥物如卡托普利(Captopril)作為對(duì)照，觀察收縮壓的變化情況。

4 油茶粕ACE抑制肽的研究現(xiàn)狀

油茶(Camellia Oleifera Abel)是世界四大木本食用油料樹種之一，是我國所特有的經(jīng)濟(jì)林植物。主要分布在淮河-秦嶺以南，北回歸線以北，云南怒江流域、青藏高原以東，東南海岸、臺(tái)灣以西。我國東部油茶種植區(qū)主要分布在海拔 800m以下的區(qū)域，而西部大多分布于海拔2 000m以上的區(qū)域[29]。近十年來，油茶的種植技術(shù)[30-31]、茶果成分及功能分析[32]、基因遺傳學(xué)特性[33]等已成為我國經(jīng)濟(jì)林樹種的研究熱點(diǎn)。油茶粕即油茶榨完油所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，經(jīng)檢測(cè)分析，油茶粕中含有大量的蛋白質(zhì)、淀粉、茶皂素和粗纖維，其中蛋白質(zhì)含量為12％～15％，是一種很好的蛋白飼料[34]。這種蛋白質(zhì)由17種氨基酸組成，其中蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等 7種是人體必需的氨基酸。在溫和的條件下，采用酶解法將油茶粕蛋白水解，可獲得具有生物活性的多肽片段及游離氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有降血壓、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等功能。目前，研究制備油茶粕蛋白及多肽的報(bào)道相對(duì)較多，但有關(guān)酶解油茶粕蛋白制備降血壓肽的研究，如對(duì)于適宜蛋白酶、特定酶解條件及多肽膜分離等關(guān)鍵技術(shù)的研究均處于試驗(yàn)探索階段。

油茶粕蛋白的提取方法主要采用傳統(tǒng)的堿提酸沉法，該方法操作簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。于衛(wèi)紅等人[35]、孫英等人[36]分別采用纖維素酶預(yù)處理和超聲預(yù)處理法來提高油茶粕蛋白的提取率，效果顯著。對(duì)于油茶粕蛋白酶解制備ACE抑制肽，大多選用堿性蛋白酶。趙延華[37]以酶解后多肽液的ACE抑制率為指標(biāo)，篩選出的最適酶為堿性蛋白酶，其最優(yōu)的酶解條件為：pH為8.1，酶與底物之比為1.57％，溫度50.5℃，時(shí)間6.66h。在此最佳條件下，油茶粕多肽的ACEI值為86.17％。丁丹華[38]采用中性蛋白酶酶解油茶粕蛋白制備ACE抑制肽，其ACEI為42％。龔吉軍[39]采用響應(yīng)面分析法對(duì)Alcalase酶解制備油茶粕多肽的條件進(jìn)行了優(yōu)化(ACEI達(dá)到84％)，并將分離純化后的油茶粕多肽(MW＜3kDa)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，油茶粕多肽(MW＜3kDa)可有效降低SHR的SBP，即具有良好的體內(nèi)降壓作用。

本實(shí)驗(yàn)室采用堿提酸沉法從油茶粕中提取油茶粕蛋白[40]，經(jīng)過蛋白酶的定向酶解，獲得了具有一定ACE抑制活性的油茶肽；還從國外引進(jìn)四種蛋白酶——Bacillus licheniformis、Aspergillus oryzae、Bacillus sp、Bacillus amyloliquefaciens 對(duì)油茶粕蛋白進(jìn)行單酶水解和聯(lián)合水解，結(jié)果表明，采用4％的Bacillus licheniformis水解效果最佳，其ACEI為52％。酶解液分別經(jīng)3、5、10kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于3kDa的組分ACE，且其抑制率最強(qiáng)，為74％，然后采用凝膠過濾層析和HPLC再將此組分進(jìn)一步分離純化，冷凍干燥，得到了含量高、活性強(qiáng)的油茶粕ACE抑制肽。有關(guān)研究結(jié)果表明，油茶粕蛋白中富含Tyr、Pro、Phe和Leu等疏水性氨基酸，具有制備降血壓多肽的功能成分[15]，所以酶法制備油茶粕ACE抑制肽是可行的。

5 展 望

21世紀(jì)是生物科技時(shí)代，尋求天然、健康的保健食品來調(diào)節(jié)人體機(jī)能的理念，已被廣大消費(fèi)者所認(rèn)可和接受。植物源ACE抑制肽，是在溫和條件下經(jīng)過食品級(jí)蛋白酶的水解而制得的，其穩(wěn)定性和安全性比合成藥物高，且無毒副作用。長期服用不僅具有較好的降血壓作用，還具有抗氧化、促進(jìn)免疫及易消化吸收等功能。因此，植物源降血壓肽具有良好的發(fā)展前景。

盡管目前國內(nèi)外在研究ACE抑制肽的分離純化方面較為復(fù)雜，投入和耗時(shí)都較多，仍有許多關(guān)鍵技術(shù)需要攻破，但隨著科學(xué)研究的深入，蛋白酶、酶解及膜分離等關(guān)鍵技術(shù)的發(fā)展，食物源蛋白降血壓活性肽制備技術(shù)將更加成熟。利用我國豐富的油茶粕蛋白資源，研制高活性降血壓肽產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)油茶副產(chǎn)物的高效利用，將是植物源ACE抑制肽研究開發(fā)的重要內(nèi)容之一。

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